|
|
Rekombinantní exprese receptoru imunoglobulinové rodiny NKp30
Tůmová, Lucie ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
NK buňky patří mezi lymfocyty přirozeného imunitního systému, které jsou schopné cytotoxicky usmrtit některé nádorové a viry infikované buňky, produkovat cytokiny a účastnit se tvorby adaptivní imunitní odpovědi. Tato bakalářská práce se zabývá lidským receptorem NK buněk, receptorem NKp30. Tento protein se řadí mezi aktivační receptory, které jsou schopny aktivovat cytotoxickou funkci NK buněk. Jeho trojrozměrná struktura a interakce mezi NKp30 a jeho fyziologickým ligandem B7-H6 byla nedávno rozřešena, nicméně interakce s jeho ostatními ligandy, BAT3 a pp65, vyřešena nebyla. Cílem práce bylo optimalizovat produkci extracelulární domény receptoru NKp30 v prokaryotickém expresním systému. Strukturní studie tohoto proteinu mohou poskytnout další detaily o interakci mezi receptorem NKp30 a jeho ligandy BAT3 a pp65.
|
|
|
Mapování protein-proteinových interakcí systému cytochromu P-450 metodami chemické modifikace a hmotnostní spektrometrie
Ječmen, Tomáš ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce)
Mapování protein-proteinových interakcí systému cytochromu P-450 metodami chemické modifikace a hmotnostní spektrometrie Abstrakt Cytochromy P-450 (P450) náleží do superrodiny hemoproteinů a v organismu se podílejí na metabolismu široké škály látek, mezi které patří některá léčiva a karcinogeny. V systému oxygenas se smíšenou funkcí plní P450 funkci terminální oxygenasy. Nezbytnou součástí je také NADPH: cytochrom P450 reduktasa (CPR), která je zodpovědná za přenos dvou elektronů na P450 v průběhu jeho katalytického cyklu. Druhý elektron může místo CPR přenášet na P450 také cytochrom b5 (cyt b5). Pro pochopení reakčního mechanismu P450 je nezbytná znalost jeho terciární struktury. V současnosti je v naší laboratoři k dispozici homologní model cytochromu P-450 2B4 (CYP 2B4). Presentovaná diplomová práce měla za cíl označení vazebné domény CYP 2B4 pro cyt b5. Ke studiu bylo použito síťovací činidlo EDC tvořící amidickou vazbu mezi aminokyselinami s opačně nabitými bočními řetězci. Pomocí hmotnostní spektrometrie se nám podařilo nalézt pět párů kovalentně propojených aminokyselin. K ověření a ke zpřesnění modelu CYP 2B4 byla použita metoda fotoafinitního značení se sondou N-(p-azidobenzyl)-N-methyl-p-aminophenylaminu. Tato sloučenina se ligandově váže na centrální atom železa hemu. Po fotoaktivaci byl pomocí...
|
|
|
Purifikace a charakterizace vybraných enzymů z Rhizobium radiobacter R89 katalyzujících oxidačně-redukční reakce na uhlíku C-hydroxylovaných morfinových skeletů.
Zahradník, Jiří ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Bakterie z rodiny Rhizobiaceae jsou známé přítomností mnoha enzymů účastnících se metabolismu dusíku. A to nejen z pohledu fixace dusíku (tzv.diazatrofie) a schopnosti tvořit s rostlinami mutualistické vztahy, ale i z pohledu rostlinné patogeneze (genus Agrobacterium). Rhizobium radiobacter R89 (uložen v České sbírce mikroorganismů v Brně jako R89-1) je bakteriální kmen schopný biotransformace kodeinu a morfinu na celé spektrum farmakologicky významných derivátů. Cílem této práce je purifikace a charakterizace dvou vybraných enzymů katalyzujících oxidačně-redukční reakce, které jsou klíčové pro začátek biodegradační dráhy morfinových skeletů. Nejprve byl charakterizován biotransformační potenciál daného kmene a pro purifikaci enzymů zodpovědných za zvolené reakce byly použity biochemické, molekulárně biologické a bioinformační metody. Vzhledem k neúspěšné purifikaci enzymů z původního materiálu byly strukturní geny kódující proteiny klonovány a heterologně exprimovány v bakteriálním expresním systému a následně charakterizovány. Nalezená proteinová sekvence a enzymová charakterizace (základní kinetické parametry, substrátová specifita a teplotní stabilita) odhalily odlišný původ enzymů a tak i objasnily neúspěch původního purifikačního postupu z mikroorganismu Rhizobium radiobacter R89.
|
|
|
Konformační změny cytochromu c v kyselém prostředí
Plutinský, Martin ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Část mojí práce bola zaměřená na rešerši literatury o konformačních změnách cytochromu c. Hlavní cíl výzkumu o této bílkovině je objasnit důležitost a roli konformačních změn. Cytochrom c se váže na vnitřní mitochondriální membránu bojatou na kardiolipin. Předpokládá se, že konformační stavy podobné molten globule hrají zatím neobjasněnou roli při spuštění apoptosy. Cytochrom c je modelový protein pro studium sbalování bílkovin. Je to jednoduchý, malý protein, který lze lehce získat a je možné ho studovat pomocí široké škály experimentálních technik. Druhá část projektu přináší experimenty s koňským cytochromem c v kyselém prostředí s přídavkem anorganických solí. Konformační změny jsem měřil pomocí UV-VIS spektrofotometrie v čtyřech oblastech absorpčního spektra - oblast absorpce aromatických aminokyselin, Soretův pás, Q pás a CT pás. Použil jsem techniku derivačních spekter pro získaní dalších informací.
|
|
|
Kinetické vlastnosti β-N-acetylhexosaminidasy z rostlin tabáku
Valenta, Robert ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Částečnou purifikací z listů tabáku (Nicotiana tabacum L.) byla získána β-N- acetylhexosaminidasa o specifické aktivitě 1,72 µmol . min-1 . mg-1 se substrátem p- nitrofenyl-β-N-acetyl-D-glukosaminid. Izoelektrická fokusace a nativní elektroforéza odhalila jedinou izoformu enzymu. Byla stanovena relativní molekulová hmotnost gelovou chromatografií (MR 275 000) a nativní elektroforézou (MR 285 000). Dále byl stanoven izoelektrický bod (pI 5,3). Aktivita β-N-acetylhexosaminidasy byla stanovena se substráty p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D-galaktosaminid i p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D- glukosaminid, a dále se substráty N,N'-diacetylchitobiosa, p-nitrofenyl-N,N'- diacetylchitobiosid a N,N',N''-triacetylchitotriosa, pro které byla optimalizována metoda stanovení pomocí kapilární elektroforézy. S jednotlivými substráty bylo stanoveno pH (4,3-5,0) i teplotní optimum (50-55 řC), byl zdokumentován průběh reakce a identifikovány produkty reakcí. Aktivita β-N-acetylhexosaminidasy byla nejvyšší se substrátem p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D-glukosaminid a nejnižší se substrátem N,N',N''- triacetylchitotriosa (35% při relativním srovnání). Se substráty p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D- glukosaminid, p-nitrofenyl-β-N-acetyl-D-galaktosaminid a N,N'-diacetylchitobiosa byla stanovena maximální rychlost reakce a Michaelisova konstanta β-N-...
|
|
|
Studium konformačních změn proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie.
Rosůlek, Michal ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Proteiny a enzymy, které ke své aktivitě vyžadují přítomnost specifického ligandu, kofaktoru, popřípadě prostetické skupiny, podléhají po navázání příslušných molekul konformačním změnám, umožňujících efektivně vykonat jejich funkci. V některých případech jsou tyto změny běžnými strukturními metodami těžko postižitelné. Využitím metody chemického zesítění s analýzou produktů pomocí hmotnostní spektrometrie lze konformační změny takovýchto proteinů zaznamenat a s nízkým rozlišením i vizualizovat. Tato práce se zabývá studiem konformačních změn indukovaných vazbou ligandu, kationtu vápníku, na molekulu modelového proteinu kalmodulinu. Kalmodulin plní funkci druhého posla v několika odlišných buněčných signalizačních drahách. Tato funkce je úzce spjata s dostatečným dynamickým rozsahem molekuly kalmodulinu. Díky této vlastnosti je kalmodulin vhodným proteinem pro identifikaci konformačních změn. Využitím činidel chemického zesítění DSG a DSS, reagujících selektivně s primárními aminy lysinů, s různou délkou spojovacího raménka, bylo po štěpení trypsinem a separaci produktů vysokoúčinnou kapalinovou chromatografíí s následnou hmotnostně spektrometrickou analýzou nalezeno sedm unikátních intraproteinových spojení. Použitím izotopově neznačených činidel v reakční směsi v přítomnosti vápenatých kationtů a...
|
|
|
Excitation of molecules by cold electrons
Šulc, Miroslav ; Horáček, Jiří (vedoucí práce)
Název práce: Excitace molekul studenými elektrony Autor: Miroslav Šulc Katedra / Ústav: Ústav teoretické fyziky, Univerzita Karlova v Praze Vedoucí disertační práce: prof. RNDr. Jiří Horáček, DrSc., Ústav teoretické fyziky, Univerzita Karlova v Praze Abstrakt: Pozornost je věnována vybraným metodám pro popis nízkoenergetických elektron-molekulových srážek. První část práce se zabývá aplikací metody R-matice v kombinaci se Schwinger-Lanczos variačním principem pro potenciálový rozptyl v pří- padě dalekodosahových interakcí. Další sekce se zaobírají aspekty konstrukce ko- relačně-polarizačního potenciálu v metodě Discrete Momentum Representation (DMR) s využitím prostředků aproximace lokální hustoty v kontextu teorie funkcionálu hus- toty (DFT). Získané poznatky jsou následně aplikovány pro body-frame výpočty na úrovni aproximace statické výměny se zahrnutou polarizací (SEP) v rámci analýzy ex- perimentálních dat pro e−-N2 srážky představující součást širšího projektu věnovaného studiu rotačních excitací malých molekul v plynné fázi iniciovaných srážkami s elek- trony. V případě N2 bylo pozorováno potlačení dozadního průřezu pro energie pod 95 meV zdůvodnitelné z teoretického hlediska destruktivní...
|
|
|
Excitation of molecules by cold electrons
Šulc, Miroslav ; Horáček, Jiří (vedoucí práce) ; Čárský, Petr (oponent) ; Čížek, Martin (oponent)
Název práce: Excitace molekul studenými elektrony Autor: Miroslav Šulc Katedra / Ústav: Ústav teoretické fyziky, Univerzita Karlova v Praze Vedoucí disertační práce: prof. RNDr. Jiří Horáček, DrSc., Ústav teoretické fyziky, Univerzita Karlova v Praze Abstrakt: Pozornost je věnována vybraným metodám pro popis nízkoenergetických elektron-molekulových srážek. První část práce se zabývá aplikací metody R-matice v kombinaci se Schwinger-Lanczos variačním principem pro potenciálový rozptyl v pří- padě dalekodosahových interakcí. Další sekce se zaobírají aspekty konstrukce ko- relačně-polarizačního potenciálu v metodě Discrete Momentum Representation (DMR) s využitím prostředků aproximace lokální hustoty v kontextu teorie funkcionálu hus- toty (DFT). Získané poznatky jsou následně aplikovány pro body-frame výpočty na úrovni aproximace statické výměny se zahrnutou polarizací (SEP) v rámci analýzy ex- perimentálních dat pro e−-N2 srážky představující součást širšího projektu věnovaného studiu rotačních excitací malých molekul v plynné fázi iniciovaných srážkami s elek- trony. V případě N2 bylo pozorováno potlačení dozadního průřezu pro energie pod 95 meV zdůvodnitelné z teoretického hlediska destruktivní...
|
|
|
Hmotnostní spektrometrie v proteomice: strukturní biologie a klinické aplikace
Pavlásková, Kateřina ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Hernychová, Lenka (oponent)
Hmotnostní spektrometrie (MS) je rychlá, specifická, citlivá a experimentálně variabilní metoda, kterou lze s úspěchem použít v celé řadě proteomických aplikací, např. při identifikaci a řešení primární struktury proteinů nebo pro studium terciární struktury a protein-proteinových interakcí. Zavedení tzv. měkkých ionizačních technik na konci 80. let minulého století umožnil ionizovat bez nežádoucí fragmentace biologické makromolekuly jako jsou proteiny, oligosacharidy nebo nukleové kyseliny, a tak nejvíce ovlivnil využití hmotnostní spektrometrie na poli proteomiky. Cílem této práce bylo použití současných přístupů hmotnostní spektrometrie při řešení několika proteomických otázek. První část práce je zaměřena na studium terciární struktury a protein-proteinových interakcí pomocí kombinace techniky chemického zesítění s MS analýzou ve třech modelových systémech: (1) homodimeru lidského regulačního proteinu 14-3-3, (2) systému proteinu 14-3-3 s regulační doménou tyrosinhydroxylasy, a (3) systému dvou membránových proteinů účastnících se biotransformace xenobiotik - cytochromu P450 2B4 a cytochromu b5. Tento metodický přístup pracuje s proteiny ve vodných roztocích za fyziologických podmínek a zachovává tak jejich nativní struktury. Ve druhé části práce byly pomocí MS studovány proteinové profily...
|
|
| |
host ::
RSS.