|
|
Exprese a vazebné vlastnosti lidského galektinu-4
Friede, Tereza ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Galektin-4, člen rodiny galektinů typický svou afinitou k β-galaktosidům, patří mezi tandemové galektiny a skládá se ze dvou odlišných podjednotek spojených peptidovým linkerem. Galektiny hrají klíčovou roli v různých biologických procesech a jsou zapojeny do patogeneze mnoha onemocnění. Tkáně s kolorektálním karcinomem (CRC) vykazují nižší expresi galektinu-4 ve srovnání se zdravými tkáněmi tlustého střeva a právě nižší exprese galektinu-4 podporuje progresi nádoru a metastáz. Bylo zjištěno, že galektin-4 inhibuje tumorigenezi buněk CRC prostřednictvím signálních drah Wnt/β-katenin a IL-6/NF- κB/STAT3, které hrají klíčovou roli ve vývoji CRC. V zánětlivých střevních onemocněních, jako je Crohnova nemoc a ulcerózní kolitida, interaguje galektin-4 s CD4+ T lymfocyty, což ovlivňuje jejich chování v imunologické synapsi. Dále se galektin-4, primárně exprimovaný v gastrointestinálním traktu, podílí na apikálním transportu v epiteliálních buňkách, podporuje hojení epiteliálních ran střeva, účastní se adaptivní imunitní odpovědi a hraje několik rolí v centrálním nervovém systému. Studium inhibitorů galektinu-4 pomáhá porozumět jeho specifickým rolím v těchto procesech, a identifikovat tak nové potenciální terapeutické cíle. V této práci byl heterologně exprimován lidský galektin-4 v bakterii Escherichia...
|
|
|
Expression and purification of proteins with unnatural aminoacids, and determination of their structure by combination of chemical or photochemical modification and mass spectrometry
Bortel, Tomáš ; Ječmen, Tomáš (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Inkorporace nepřirozených aminokyselin (NNAA) je široce používaný způsob pro zavedení bioorthogonálních funkčních skupin do proteinů26 . Tyto funkční skupiny lze využít použitím click chemie, konjugací značených proteinů na afinitní nebo fluorescenční sondy. Méně rozšířené využití NNAA zahrnuje výzkum vlivu bioorthogonálních funkčních skupin na strukturně - funkční vztahy v značených proteinech47 . Pro výzkum těchto vztahů je zapotřebí exprimovat velké množství proteinu s maximální inkorporací NNAA. V naší práci jsme nahrazovali methionin (Met) třemi NNAA: foto-methioninem (pMet), azidohomoalaninem (AHA) a homopropargylglycinem (HPG). Zkoumali jsme vliv těchto NNAA na růst prototrofních E. coli BL21 a Met-auxotrofních E. coli B834 v MM- -M9 médiu. Sledovali jsme expresi cytochromu b5 a MBP-GFP. Pro určení míry inkorporace jednotlivých NNAA do těchto rekombinantních proteinů jsme použili MALDI-ToF MS a LC-MS. V porovnání s Met-auxotrofními E.coli B834, prototrofické E. coli BL21 exprimovaly výrazně vyšší množství cytochromu b5 s pMet a AHA, avšak s nízkými inkorporacemi těchto NNAA. Situace byla opačná v B834, které exprimovaly výrazně nižší množství proteinu, avšak s inkorporací pMet od 50 - 70 % a AHA kolem 50 %. Oba bakteriální kmeny s HPG exprimovaly podobné množství cytochromu b5 s...
|
|
|
In vivo biotinylace jako nová metoda značení galektinů
Balogová, Soňa ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Galektiny jsou živočišné lektiny s afinitou k terminálním β-galaktosidům. Tyto lektiny jsou charakteristické evolučně konzervovanou doménou rozpoznávající sacharidy (CRD). Galektiny se in vivo účastní mnoha procesů, jako např. buněčné adheze; signalizace; proliferace buněk a kancerogeneze. Lze je využít jako markery u některých typů rakovin a též pro cílenou vazbu terapeutik v diagnostice a terapii rakovinného bujení. Galektiny byly definovány jako proteinová rodina složená z 15 členů (11 z nich známo u lidí). Jsou klasifikovány do tří podskupin, dle své struktury: prototypické; chimerické; tandemové. Galektin-8 patří mezi tandemové galektiny, které jsou tvořeny dvěma různými podjednotkami spojenými peptidovým můstkem; obsahují dvě různé CRD domény, a jsou proto bivalentní. Interakce galektin-glykan jsou založeny na afinitě CRD galektinů ke glykanům obsahujícím terminální β-galaktosid, přičemž tuto afinitu formuluje právě soubor konzervovaných aminokyselin v rámci každého CRD. Tyto interakce je možno zkoumat mnohými metodami, jako např. rentgenová krystalografie; kompetitivní ELISA; interferometrie na biovrstvě. Díky širokému zapojení galektinů do biologických procesů je známa řada metod značení galektinů pro jejich detekci. Nejpoužívanějšími metodami jsou fluorescenční metody a biotinylace...
|
|
|
Glykokalixareny a jejich afinita k lidským galektinům
Bálková, Denisa ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Kalix[n]areny jsou makrocyklické sloučeniny vytvořené oligomerizací fenolu a formaldehydu. Mohou být složeny z různého počtu aromatických kruhů a zaujímat odlišné konformace. Vzhledem k jejich snadné modifikovatelnosti nalézají mnoho uplatnění, a to zejména v průmyslu či medicíně. Modifikovány mohou být většinou funkčních skupin od hydroxylových, aminových či karboxylových až například po sacharidové jednotky. V takovém případě vznikají glykokalix[n]areny. Galektiny, tedy lektiny S-typu, jsou schopny specificky rozpoznávat a následně vázat řadu glykokonjugátů. Je to ovšem možné pouze v případě, kdy molekula prezentuje β-D-galaktosidy. Galektiny mají pro jednotlivé ligandy odlišné afinity, přičemž bylo prokázáno, že pokud jsou β-D-galaktosidy konjugovány k multivalentnímu nosiči, má výsledný glykokonjugát afinitu ke galektinu výrazně zvýšenou. Pomocí specifických ligandů je možné ovlivňovat mnohé funkce galektinů. Těmi jsou například buněčná adheze, regulace apoptózy, proliferace, buněčná signalizace a imunitní odpověď. Těmito cestami mohou galektiny taktéž způsobovat závažná onemocnění, jimiž jsou kupříkladu autoimunitní onemocnění či vznik karcinomů. Předmětem mnoha výzkumů je tedy nalezení takových ligandů galektinů, kterými by se daným jevům dalo zabránit nebo by pomohly v jejich léčbě. V rámci...
|
|
| |
|
|
Exprese a purifikace N-koncové části filamentózního hemaglutininu z Bordetella Pertussis v E. Coli
Jurnečka, David ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
: Černý kašel je vysoce nakažlivé onemocnění způsobené gramnegativní bakterií Bordetella pertussis. V průběhu infekce bakterie produkuje celou řadu toxinů a adhezivních molekul, mezi něž patří i filamentózní hemaglutinin (FHA). FHA je 220 kDa povrchový protein, jenž je také produkován ve velkém množství do média, a hraje klíčovou úlohu v interakci mezi bakterií a hostitelskými buňkami. Cílem této práce bylo vytvořit heterologní expresní systém na produkci N-koncové části B. pertussis FHA (FHA1-862) v buňkách Escherichia coli. Pro sekreci proteinu FHA1-862 do media byl vytvořen plasmid skládající se ze systému dvou nezávislých T7/Lac promotorů, první pro gen fhaB kódující FHA1-862, a druhý pro gen fhaC kódující transportní protein, jenž umožňuje přenos FHA z periplasmatického prostoru do extracelulárního média. Protein byl úspěšně sekretován v buňkách E. coli BL21 nesoucí plasmid pMM100 (LacIq ) při 30 řC a přečištěn pomocí afinitní kapalinové chromatografie na nosiči Cellufine. Tyto výsledky naznačují, že protein FHA862 může být produkován expresním systémem E. coli, nicméně tento systém poskytuje malou výtěžnost proteinu.
|
|
|
Sledování vlivu quambalarinu B na aminokyselinový metabolismus leukemických buněčných linií
Matoušková, Zuzana ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Prošková, Veronika (oponent)
Leukémie je nejčastější onkologické onemocnění u pacientů dětského věku, avšak ani u starších pacientů není toto onemocnění vzácné. To je hlavní důvod, že se v posledních letech výzkum zaměřil na vývoj specifických antileukemických léčiv. Klíčové se zdají být abnormality metabolismu nádorových buněk na které se dá cílit při léčbě. Přírodní 1,4-naftochinony, mezi něž patří i quambalarin B produkovaný jako sekundární metabolit basidiomycetami Quambalaria cyanescens, jsou známé pro své léčebné účinky. Není tak překvapením, že i u quambalarinu B bylo prokázáno, že u některých leukemických buněčných linií inhibuje buněčnou proliferaci a následně způsobuje buněčnou smrt. V předkládané práci jsem se pomocí aminokyselinové analýzy s fluorescenční detekcí snažila pozorovat změny metabolismu aminokyselin, a to sledováním aminokyselinových hladin v intracelulárním a extracelulárním prostředí leukemických buněk po ošetření quambalarinem B. Pozorování bylo prováděno u buněčné linie Jurkat, Ramos a THP-1, přičemž každá z těchto linií představuje jiný typ leukemického onemocnění. Klíčová slova Aminokyselinová analýza, metabolismus aminokyselin, quambalarin B, leukémie
|
|
|
The novel combinations of experimental approaches: mass spectrometry (MS) and photo-induced surface labelling, electron release (PIER), or cross-linking (PIXL)
Tuzhilkin, Roman ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
V živých organismech probíhá každým okamžikem nespočet dějů s účastí přenosu/transportu elektronu (ET). Proto jejich studium je důležitým cílem moderní strukturně-funkční proteomiky. Pro řadu experimentů byl a je používán modelový protein azurin z P. aeruginosa. Tento modrý protein obsahující centrální atom mědi má charakteristické absorpční maximum při 630 nm v redoxním stavu Cu(II). Během jeho oxidace na Cu(I) dochází k poklesu hodnoty absorbance při 630 nm (A630) a tak lze UV-Vis spektra použít pro sledování průběhu jeho ET reakcí. Naším cílem bylo vložit světlem aktivovatelný strukturní analog kanonické aminokyseliny Met - L-2-amino-5,5-azihexanovou kyselinu (foto-Met) - do sekvence azurinu a využít vzniklý proteinový produkt pro studium oligomerizace azurinu v roztoku pomocí techniky světlem iniciovaného síťování (PIXL). Použitím optimalizovaných protokolů pro rekombinantní expresi v E. coli B834 jsme vložili foto-Met do přirozeného azurinu a konstruktu Az2W, ve kterém jsou přítomny dva blízké Trp, u kterých byla potvrzena role při elektronovém přeskoku ("hopping") napříč protein-proteinovým rozhraním. Míra inkorporace foto-Met do sekvence proteinů byla určena pomocí MALDI-TOF MS po separaci proteinů na SDS-PAGE a štěpení proteasou v gelu. Pomocí metody PIXL byl studován vliv rostoucí celkové...
|
|
|
Studium receptoru dendritickych bunek DCL-1 pomocí technik NMR
Pospíšilová, Eliška ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Schneider, Bohdan (oponent)
(ČJ) Receptor DCL-1 (CD302) vyskytující se především na povrchu dendritických buněk je na základě sekvenční podobnosti zařazen do rodiny C-lektinových receptorů. Jelikož však jeho extracelulární doména postrádá jakékoli motivy pro vazbu sacharidových struktur v koordinaci s kationtem vápníku, lze předpokládat, že pokud bude sacharidové struktury vázat, nebude se tak dít klasickou cestou jako například u manosového receptoru nebo receptoru DEC-205. V rámci kolokalizace DCL-1 s F-aktinem se nabízí předpoklad, že hraje určitou roli v buněčné adhezi a migraci. Další předpokládanou funkcí DCL-1 je receptorem zprostředkovaná endocytóza a následné směrování do lysozomů. V posledních letech byl tento receptor také spojován s rozličnými patologickými stavy. Experimentální část této práce lze rozdělit do tří úrovní. V první fázi proběhla produkce proteinového konstruktu založeného na extracelulární doméně DCL-1 v M9 minimálním médiu, kde byl přítomen jako jediný zdroj dusíku 15 NH4Cl a jediný zdroj uhlíku 13 C glukóza. Tímto byl získán 15 N a 13 C značený protein, který byl použit pro NMR měření. Druhá část práce se zabývá vyhodnocením NMR spekter, která umožnila přiřazení frekvencí atomům peptidové páteře i alifatických postranních řetězců aminokyselin. Na základě informace o chemických posunech jader...
|
|
|
Multivalentní sacharidové ligandy galektinů
Hovorková, Michaela ; Křen, Vladimír (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Galektiny jsou proteiny patřící do skupiny lektinů, které jsou schopné vázat sacharidové jednotky a dokážou specificky rozeznat glykany vystavené na povrchu buněk. Galektiny se in vivo účastní např. kancerogeneze, angiogeneze či fibrózy. Jejich výskyt signifikantně stoupá v souvislosti s řadou patogenních procesů, a proto je lze využít jako markery u některých typů rakovin nebo kardiopatologií a též pro cílenou vazbu terapeutik a/ nebo zobrazovacích činidel v diagnostice a terapii. Galektin-3 má specifickou strukturu označovanou jako chimerická a je schopný tvořit multivalentní oligomery. Přirozenými ligandy galektinů jsou glykany obsahující terminální β-galaktosidy, zvláště N-acetyllaktosamin, avšak vazba monovalentních glykanů je velmi slabá. Glykokonjugáty s vysokou afinitou ke galektinovým receptorům jsou optimálně multivalentní, biokompatibilní a stabilní in vivo. Tato kritéria splňují sacharidové ligandy konjugované na rozpustné a strukturně flexibilní N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidové (HPMA) kopolymery. V rámci této práce byly pomocí enzymové syntézy připraveny dva druhy funkcionalizovaných disacharidů, založené na N-acetyllaktosaminu (Galβ4GlcNAc) a jeho strukturním analogu N,N'-diacetyllaktosaminu (GalNAcβ4GlcNAc). Pro syntézu byl použit komerční enzym β-galaktosidasa z Bacillus...
|
host ::
RSS.