|
|
Studium vlivu kofaktoru na strukturu proteinu pomocí hmotnostní spektrometrie
Rosůlek, Michal ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Bakteriální protein WrbA z E. coli je zakládajícím členem nové rodiny FMN dependentních NAD(P)H oxidoreduktas, tvořící funkční i strukturní vývojový stupeň mezi bakteriálními flavodoxiny a některými savčími NAD(P)H:chinon oxidoreduktasami. Z těchto důvodů je protein WrbA v poslední době intenzivně studován pomocí různých analytických metod i počítačových simulací. Protein WrbA participuje na ochraně buněk před oxidativním stresem, přesná funkce proteinu WrbA in vivo je však stále neznámá. Protein WrbA tvoří v roztocích multimery, v μM koncentracích se při nízkých teplotách (4 řC) nachází ve formě dimeru, s rostoucí teplotou tetramerizuje. Dostupné trojrozměrné krystalové struktury obsahují informace pouze o tetramerní formě proteinu, dimerní forma dosud nebyla strukturně charakterizována. Tato práce byla zaměřena na studium dynamického chování proteinu v roztoku metodami vodík-deuteriové výměny a chemického síťování s následnou analýzou hmotnostním spektrometrem s vysokým rozlišením (FT-ICR). Sledováno bylo chování proteinu v závislosti na vazbě kofaktoru FMN nebo změnách teploty a koncentrace. Analýzou dat z vodík-deuteriové výměny byly získány informace o přístupnosti rozpouštědla a dynamice pro kompletní sekvenci proteinu. Popsán byl stabilizační vliv kofaktoru na tetramerní strukturu proteinu,...
|
|
|
Studium konformačních změn proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie.
Rosůlek, Michal ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Proteiny a enzymy, které ke své aktivitě vyžadují přítomnost specifického ligandu, kofaktoru, popřípadě prostetické skupiny, podléhají po navázání příslušných molekul konformačním změnám, umožňujících efektivně vykonat jejich funkci. V některých případech jsou tyto změny běžnými strukturními metodami těžko postižitelné. Využitím metody chemického zesítění s analýzou produktů pomocí hmotnostní spektrometrie lze konformační změny takovýchto proteinů zaznamenat a s nízkým rozlišením i vizualizovat. Tato práce se zabývá studiem konformačních změn indukovaných vazbou ligandu, kationtu vápníku, na molekulu modelového proteinu kalmodulinu. Kalmodulin plní funkci druhého posla v několika odlišných buněčných signalizačních drahách. Tato funkce je úzce spjata s dostatečným dynamickým rozsahem molekuly kalmodulinu. Díky této vlastnosti je kalmodulin vhodným proteinem pro identifikaci konformačních změn. Využitím činidel chemického zesítění DSG a DSS, reagujících selektivně s primárními aminy lysinů, s různou délkou spojovacího raménka, bylo po štěpení trypsinem a separaci produktů vysokoúčinnou kapalinovou chromatografíí s následnou hmotnostně spektrometrickou analýzou nalezeno sedm unikátních intraproteinových spojení. Použitím izotopově neznačených činidel v reakční směsi v přítomnosti vápenatých kationtů a...
|
|
|
Studium vlivu kofaktoru na strukturu proteinu pomocí hmotnostní spektrometrie
Rosůlek, Michal ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Bakteriální protein WrbA z E. coli je zakládajícím členem nové rodiny FMN dependentních NAD(P)H oxidoreduktas, tvořící funkční i strukturní vývojový stupeň mezi bakteriálními flavodoxiny a některými savčími NAD(P)H:chinon oxidoreduktasami. Z těchto důvodů je protein WrbA v poslední době intenzivně studován pomocí různých analytických metod i počítačových simulací. Protein WrbA participuje na ochraně buněk před oxidativním stresem, přesná funkce proteinu WrbA in vivo je však stále neznámá. Protein WrbA tvoří v roztocích multimery, v μM koncentracích se při nízkých teplotách (4 řC) nachází ve formě dimeru, s rostoucí teplotou tetramerizuje. Dostupné trojrozměrné krystalové struktury obsahují informace pouze o tetramerní formě proteinu, dimerní forma dosud nebyla strukturně charakterizována. Tato práce byla zaměřena na studium dynamického chování proteinu v roztoku metodami vodík-deuteriové výměny a chemického síťování s následnou analýzou hmotnostním spektrometrem s vysokým rozlišením (FT-ICR). Sledováno bylo chování proteinu v závislosti na vazbě kofaktoru FMN nebo změnách teploty a koncentrace. Analýzou dat z vodík-deuteriové výměny byly získány informace o přístupnosti rozpouštědla a dynamice pro kompletní sekvenci proteinu. Popsán byl stabilizační vliv kofaktoru na tetramerní strukturu proteinu,...
|
|
|
Studium konformačních změn proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie.
Rosůlek, Michal ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Proteiny a enzymy, které ke své aktivitě vyžadují přítomnost specifického ligandu, kofaktoru, popřípadě prostetické skupiny, podléhají po navázání příslušných molekul konformačním změnám, umožňujících efektivně vykonat jejich funkci. V některých případech jsou tyto změny běžnými strukturními metodami těžko postižitelné. Využitím metody chemického zesítění s analýzou produktů pomocí hmotnostní spektrometrie lze konformační změny takovýchto proteinů zaznamenat a s nízkým rozlišením i vizualizovat. Tato práce se zabývá studiem konformačních změn indukovaných vazbou ligandu, kationtu vápníku, na molekulu modelového proteinu kalmodulinu. Kalmodulin plní funkci druhého posla v několika odlišných buněčných signalizačních drahách. Tato funkce je úzce spjata s dostatečným dynamickým rozsahem molekuly kalmodulinu. Díky této vlastnosti je kalmodulin vhodným proteinem pro identifikaci konformačních změn. Využitím činidel chemického zesítění DSG a DSS, reagujících selektivně s primárními aminy lysinů, s různou délkou spojovacího raménka, bylo po štěpení trypsinem a separaci produktů vysokoúčinnou kapalinovou chromatografíí s následnou hmotnostně spektrometrickou analýzou nalezeno sedm unikátních intraproteinových spojení. Použitím izotopově neznačených činidel v reakční směsi v přítomnosti vápenatých kationtů a...
|
host ::
RSS.