|
|
Příprava lidského a schistosomálního kathepsinu L v enzymaticky aktivní formě
Horáková, Lenka ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Kathepsinové proteasy typu L se účastní řady patologických procesů a jejich inhibitory jsou atraktivními molekulami pro vývoj nových léčiv. Diplomová práce se zabývá lidským kathepsinem L (hCL) a kathepsinem L3 z parazitické krevničky střevní (Schistosoma mansoni) (SmCL3). hCL je spojován s nádorovými onemocněními a Covid-19, zatímco SmCL3 je trávicím enzymem S. mansoni způsobující onemocnění schistosomózu. Cílem diplomové práce byla příprava rekombinantních kathepsinů L v enzymaticky aktivní formě citlivé k inhibitorům. V případě hCL byly identifikovány podmínky pro řízenou autoaktivaci prekurzorových forem na zralou formu enzymu a optimalizovat tento proces závislý na pH a teplotě. V případě SmCL3 byl navržen protokol pro purifikaci zralé formy z expresních médií kvasinky Komagataella pastoris. Senzitivita připraveného hCL a SmCL3 k inhibici byla ověřena pomocí modelového peptidomimetického vinylsulfonu, jehož hodnoty IC50 byly v oblasti sub/nanomolárních koncentrací. Klíčová slova: proteolytické enzymy, aktivita a inhibice enzymů, funkční proteomika, rekombinantní exprese proteinů, struktura proteinů
|
|
|
Vývoj nových radikálových sond pro strukturní charakterizaci proteinů
Karpíšek, Michael ; Kukačka, Zdeněk (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Proteiny jsou důležité biomolekuly, které v buňce zastávají nespočet důležitých funkcí. Protože funkce těchto biomolekul často úzce souvisí s jejich strukturou, bylo vyvinuto mnoho technik sloužících ke studiu jejich trojrozměrného uspořádání, z nichž každá má své přednosti, ale také nevýhody. Chemické zesítění v kombinaci s hmotnostní spektrometrií, které využívá výhod hmotnostní spektrometrie ke strukturní charakterizaci analytu, je jednou z těchto metod. Přestože je tato metoda již dlouho známa, dosud nebylo vyvinuto činidlo vázající postranní řetězce všech proteinogenních aromatických aminokyselin. V této práci byla ověřena reaktivita nového síťovacího činidla, které by mělo selektivně modifikovat postranní řetězce aromatických aminokyselin a také aminokyseliny cysteinu. Toto činidlo bylo navrženo na základě prací s takzvanými Togniho činidly, která slouží k trifluoralkylaci aromátů. K optimalizaci vlivu různých podmínek na výtěžek reakce měřením intaktního proteinu elektrosprejovou ionizací byl vybrán apomyoglobin. Přístup zdola nahoru byl využit k nalezení postranních řetězců, na kterých došlo k modifikaci. Pro tento účel byl kromě apomyoglobinu vybrány proteiny RhoA a HSC70, které ve své struktuře obsahují cysteiny, které netvoří disulfidické můstky. Na základě obdržených dat byla potvrzena...
|
|
|
Studium struktury a interakcí proteinů pomocí strukturní hmotnostní spektrometrie
Portašiková, Jasmína Mária ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Vrbacký, Marek (oponent)
Transmembránové kanály a přenášeče z ClC proteinové rodiny se vyskytují napříč všemi živými organismy. Nacházejí se na cytoplasmatických a lysosomálních membránách buněk, kde se podílí na udržování homeostázy iontů. Narušení jejich funkce vede k vážným zdravotním komplikacím. Pro vývoj efektivní léčby těchto onemocnění je potřeba objasnit transportní mechanismus ClC proteinů. Antiporter ClC-ec1 z E.coli je modelovým proteinem celé ClC proteinové rodiny. Tento homodimerní protein, který transportuje proton proti dvěma chloridovým iontům, má transportní dráhu v každé z podjednotek. Na základě krystalové struktury se přepokládá, že během transportu se protein střídavě otevírá na obě strany membrány. Otevření proteinu směrem ven je umožněno protonací tří glutamátů, které se nacházejí v transportní dráze a jsou pro transport iontů klíčové. Pro studium tohoto stavu byl navržen QQQ mutant, který má tyto glutamáty nahrazeny za glutaminy. Dosud se studium transportního mechanismu ClC-ec1 opíralo převážně o studie založené na rentgenové krystalografii. Krystalografie poskytla statické obrázky, které neobsahovaly dostatečné informace o dynamice proteinu. Proto jsme pro studium transportního mechanismu ClC-ec1 zvolili dynamickou metodu - vodík-deuteriovou výměnu spojenou s hmotnostní spektrometrií. Součástí...
|
|
|
Specificita interakcí protein-protein a jejich modulace
Pham, Phuong Ngoc ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Damborský, Jiří (oponent) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
(CZ) Protein-proteinové interakce (PPI) mají zásadní roli v životních procesech a jejich abnormality jsou často spojené s vznikem nemocí. Vzhledem ke své důležitosti dostávají PPI čím dál tím více pozornosti a staly se cíli zásahu různých léčiv. Návrh konkrétních PPI a jejich modulace je však náročný. Interakce cytokinů s jejich receptory jsou zvláště důležité při regulaci imunitního systému. Nadměrná produkce interleukinu-10 (IL-10) má za následek nadměrné imunosupresivní účinky, růst nádoru a infekci. Interakce mezi receptorem interferonu gama 2 (IFN-γR2) a interferonem gama (IFN-γ) vede k aktivaci signálních drah, ale mechanismus takové interakce je stále nepopsaný. Interleukin-24 (IL-24) je další cytokin, který signalizuje prostřednictvím receptorů sdílejících receptorovou podjednotku 2 interleukinu-20 (IL-20R2) a má důležitou roli v autoimunitě a rakovině. Cílem této Ph.D. práce je studium PPI z několika hledisek s důrazem na jejich specifičnost. Prvním cílem je vyvinout nové proteinové lešení, které bude následně použito pro vývoj vysokoafinitního pojiva specifického pro lidský IL-10. Druhým cílem je pochopení strukturního základu receptorové specifity lidského IFN-γ. Třetím cílem je modulace vazebné afinity mezi lidským IL-24 a jeho receptorem IL-20R2 za použití foto-responzivních...
|
|
|
Utilization of pulse labelling techniques for studying the dynamics of proteins and protein complexes
Polák, Marek ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Vrbacký, Marek (oponent)
(In Czech) Hmotnostní spektrometrie (MS) se stala častou technikou pro sledování struktury a dynamiky proteinů a proteinových komplexů. I když techniky založené na MS detekci nemohou poskytovat informace s vysokým rozlišením, jako je např. rentgenová difrakce, nukleární magnetická rezonance (NMR), nebo kryo-elektronová mikroskopie (cryo-EM), jsou dobrým nástrojem z hlediska poskytování informaci ohledně dynamiky, struktury a interakcí analytů s dalšími molekulami, např. ligandy. Tato doktorská práce představuje přínos do oblasti strukturní biologie při využití kovalentního značení, tzv. rychlé fotochemické oxidace proteinů (FPOP) a oxidace singletním kyslíkem (1 O2) pro studium struktury, dynamiky a interakcí proteinů a proteinových komplexů s dvoušroubovici DNA.V první části práce byla metoda FPOP využita k studiu struktury komplexu FOXO4-DAF16, která poukázala na možnosti analýzy takového komplexu pomocí přístupů "bottom-up" a "top-down". Dále je zde představena strategie izotopové deplece pro strategii "top- down", kde je demonstrována její výhoda ve spojení s multiCASI-ECD za účelem získaní nejvyšší možné strukturní informace ohledně interakce FOXO4 s IRE. Studie ukazuje, jak mohou informace získané ze strukturní proteomiky vést k vytvoření in-silico modelů protein-DNA komplexů, jejichž...
|
|
|
Predikce proteinových domén
Valenta, Martin ; Martínek, Tomáš (oponent) ; Burgetová, Ivana (vedoucí práce)
Práce představuje oblast proteinů a jejich domén. Stručně popisuje metody získání proteinové struktury na různých úrovních hierarchie. Pozornost je dále věnována existujícím nástrojům pro predikci proteinových domén a databázím sdružujícím informace o doménách. Dále jsou představeni vybraní zástupci metod predikce pracující jak s informacemi o vnitřní struktuře molekuly, tak se sekvencí aminokyselin. V příslušné kapitole je nastíněn realizovaný postup predikce hranic domén z primární struktury proteinu, využívající neuronovou síť. Zbývající část práce se zabývá testováním vytvořené implementace metodou křížové validace a možnostmi jejího dalšího rozvoje.
|
|
|
Struktura a interakce lidského regulačního proteinu 14-3-3 pomocí in vitro fotoafinitního značení s využitím proteinových nano-sond a hmotnostní spektrometrie
Mazurová, Martina ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Tato bakalářská práce je zaměřená na studium struktury a mechanismu lidského proteinu 14-3-3, který patří mezi významné regulační proteiny vyskytující se ve všech eukaryotických buňkách. V dnešní době je u savců známo 7 isoforem tohoto proteinu a přestože jejich krystalová struktura vykazuje vysokou podobnost, můžeme pozorovat několik změn. Cílem této práce je příprava experimentálního nástroje, který umožní ověřit, zda jsou tyto rozdíly v krystalové struktuře isoformy ζ přítomné i v roztocích proteinů a současně zda ovlivňují strukturně funkční mechanismus této isoformy. Optimalizace exprese rekombinantního proteinu 14-3-3zeta s inkorporovaným fotoaktivovatelným analogem leucinu v sekvenci proteinu byla provedena v limitním médiu s prokaryotním expresním systémem E. coli BL-21 DE3 Gold, nebo auxotrofním systémem E. coli K-12 bez funkční biosynthesy leucinu.
|
|
|
Parazitární cystatiny jako inhibitory cysteinových proteas: strukturní aspekty funkční specifity a evoluce
Buša, Michal ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Proteiny z rodiny cystatinů jsou důležitými inhibitory cysteinových proteas typu katepsinů a účastní se řady patologií. Parazitární cystatiny jsou atraktivní cílové molekuly pro regulaci parazitů, ale je o nich dosud málo informací. Tato práce se zaměřuje na cystatiny dvou významných krevsajících parazitů: klíštěte obecného (Ixodes ricinus) jako hlavního vektoru lymské boreliózy a klíšťové encefalitidy, a motolice jaterní (Fasciola hepatica), původce fasciolózy. Byla provedena funkční a rentgenostrukturní charakterizace čtyř nových cystatinů, která umožnila určit strukturní příčiny inhibiční specifity a vysvětlit je v kontextu evoluce cystatinů a jejich fyziologické role. Cystatin FhCyLS-2 z F. hepatica má širokou inhibiční specifitu a hraje pravděpodobně duální roli při regulaci proteolytických systémů v tkáni hostitele a ve střevu parazita. FhCyLS-2 kombinuje unikátním způsobem charakteristiky dvou podrodin cystatinů a představuje modelového zástupce nové evoluční skupiny cystatinů identifikované u několika řádů parazitických motolic. Ricistatin a iristatin jsou cystatiny ze slin I. ricinus, jejichž imunomodulační působení na hostitele je způsobeno výjimečně úzkou inhibiční specifitou. Ta byla vysvětlena strukturními modifikacemi ve vazebných segmentech inhibitorů. Modifikace mají jiný charakter u...
|
|
|
Engineering and selection of protein binders recognising medically important cytokines
Huličiak, Maroš
in Czech Proteinovému inženýrství se dostává čím dál tím více pozornosti jakožto užitečnému nástroji v oblasti biotechnologií a moderní medicíny. Malé, uměle vytvořené molekuly odvozené ze stabilních proteinů, tzv. skafoldů, jsou potenciální náhradou široce používaných protilátek. V této práci představuji využití dvou takovýchto skafoldů navržených v naší laboratoři pro vývoj stabilních vazebných proteinů s vysokou vazebnou afinitou i specifitou. Tato práce pojednává konkrétně o vývoji dvou vazebných molekul interagujících s lékařsky důležitými lidskými cytokiny a jejich buněčnými receptory - jmenovitě s interleukinem-10, receptorem interleukinu- 28 a alfa receptorem interleukinu-9. Rekombinantní cytokiny i oba receptory byly ve vysoké kvalitě a s vysokými výtěžky produkovány v eukaryotických buňkách a sloužily jako molekulární cíle pro selekci pomocí displejových metod řízené evoluce. Prokázali jsme, že aplikace ribozomálního a kvasinkového displeje, nebo jejich nekonvenční kombinace vede k úspěšnému generování vysoce afinitních a specifických vazebných molekul založených na nově navržených proteinových skafoldech nazvaných 57aBi a 57bBi.
|
|
|
Engineering and selection of protein binders recognising medically important cytokines
Huličiak, Maroš ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Pichová, Iva (oponent) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
in Czech Proteinovému inženýrství se dostává čím dál tím více pozornosti jakožto užitečnému nástroji v oblasti biotechnologií a moderní medicíny. Malé, uměle vytvořené molekuly odvozené ze stabilních proteinů, tzv. skafoldů, jsou potenciální náhradou široce používaných protilátek. V této práci představuji využití dvou takovýchto skafoldů navržených v naší laboratoři pro vývoj stabilních vazebných proteinů s vysokou vazebnou afinitou i specifitou. Tato práce pojednává konkrétně o vývoji dvou vazebných molekul interagujících s lékařsky důležitými lidskými cytokiny a jejich buněčnými receptory - jmenovitě s interleukinem-10, receptorem interleukinu- 28 a alfa receptorem interleukinu-9. Rekombinantní cytokiny i oba receptory byly ve vysoké kvalitě a s vysokými výtěžky produkovány v eukaryotických buňkách a sloužily jako molekulární cíle pro selekci pomocí displejových metod řízené evoluce. Prokázali jsme, že aplikace ribozomálního a kvasinkového displeje, nebo jejich nekonvenční kombinace vede k úspěšnému generování vysoce afinitních a specifických vazebných molekul založených na nově navržených proteinových skafoldech nazvaných 57aBi a 57bBi.
|
host ::
RSS.