|
|
Vývoj nových izotopově značených sond pro relativní kvantifikaci proteinů
Procházková, Valérie ; Kukačka, Zdeněk (vedoucí práce) ; Vaňková, Pavla (oponent)
Objasnění struktury proteinů v živých organismech je důležitým krokem pro popis jejich úlohy v organismu. Jednou z metod strukturní biologie je chemické zesítění v kombinaci s hmotnostní spektrometrií, která je běžně používaným nástrojem pro charakterizaci terciální struktury proteinů nebo protein-proteinových interakcí. Tato metoda je založena na reakci síťovacího činidla, složeného ze dvou reaktivních skupin propojených raménkem o definované délce za vzniku kovalentní vazby. Hlavním cílem této práce bylo ověřit, zda je možné využít chemické zesítění v kombinaci s izotopově značenými činidly ke kvantifikaci dvou odlišných strukturních stavů. V práci byla využita činidla DSPU (disukcinimidyldipropionát močovina) a izotopově značená forma DSPUx. Činidla DSPU i DSPUx obsahují ve své struktuře labilní molekulu močoviny, která je při kolizně indukované disociaci štěpena na charakteristické fragmenty, díky kterým lze identifikovat zesítěné peptidy. Přístupy shora dolů a zdola nahoru bylo na vybraných proteinech (insulin, lidská karbonická anhydrasa a hovězí sérový albumin) zjištěno, že činidla DSPU a DSPUx interagují s vybranými peptidy a proteiny a jsou vhodná pro jejich kvantifikaci. Na modelu myoglobinu byly následně sledovány strukturní rozdíly v jeho dvou konformačních stavech, v přítomnosti hemu...
|
|
|
Parazitární cystatiny jako inhibitory cysteinových proteas: strukturní aspekty funkční specifity a evoluce
Buša, Michal ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Proteiny z rodiny cystatinů jsou důležitými inhibitory cysteinových proteas typu katepsinů a účastní se řady patologií. Parazitární cystatiny jsou atraktivní cílové molekuly pro regulaci parazitů, ale je o nich dosud málo informací. Tato práce se zaměřuje na cystatiny dvou významných krevsajících parazitů: klíštěte obecného (Ixodes ricinus) jako hlavního vektoru lymské boreliózy a klíšťové encefalitidy, a motolice jaterní (Fasciola hepatica), původce fasciolózy. Byla provedena funkční a rentgenostrukturní charakterizace čtyř nových cystatinů, která umožnila určit strukturní příčiny inhibiční specifity a vysvětlit je v kontextu evoluce cystatinů a jejich fyziologické role. Cystatin FhCyLS-2 z F. hepatica má širokou inhibiční specifitu a hraje pravděpodobně duální roli při regulaci proteolytických systémů v tkáni hostitele a ve střevu parazita. FhCyLS-2 kombinuje unikátním způsobem charakteristiky dvou podrodin cystatinů a představuje modelového zástupce nové evoluční skupiny cystatinů identifikované u několika řádů parazitických motolic. Ricistatin a iristatin jsou cystatiny ze slin I. ricinus, jejichž imunomodulační působení na hostitele je způsobeno výjimečně úzkou inhibiční specifitou. Ta byla vysvětlena strukturními modifikacemi ve vazebných segmentech inhibitorů. Modifikace mají jiný charakter u...
|
|
|
Engineering and selection of protein binders recognising medically important cytokines
Huličiak, Maroš ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Pichová, Iva (oponent) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
in Czech Proteinovému inženýrství se dostává čím dál tím více pozornosti jakožto užitečnému nástroji v oblasti biotechnologií a moderní medicíny. Malé, uměle vytvořené molekuly odvozené ze stabilních proteinů, tzv. skafoldů, jsou potenciální náhradou široce používaných protilátek. V této práci představuji využití dvou takovýchto skafoldů navržených v naší laboratoři pro vývoj stabilních vazebných proteinů s vysokou vazebnou afinitou i specifitou. Tato práce pojednává konkrétně o vývoji dvou vazebných molekul interagujících s lékařsky důležitými lidskými cytokiny a jejich buněčnými receptory - jmenovitě s interleukinem-10, receptorem interleukinu- 28 a alfa receptorem interleukinu-9. Rekombinantní cytokiny i oba receptory byly ve vysoké kvalitě a s vysokými výtěžky produkovány v eukaryotických buňkách a sloužily jako molekulární cíle pro selekci pomocí displejových metod řízené evoluce. Prokázali jsme, že aplikace ribozomálního a kvasinkového displeje, nebo jejich nekonvenční kombinace vede k úspěšnému generování vysoce afinitních a specifických vazebných molekul založených na nově navržených proteinových skafoldech nazvaných 57aBi a 57bBi.
|
|
|
Rozvoj techniky separace a identifikace glykopeptidů pomocí chromatografie a hmotnostní spektrometrie pro klinické účely
Petroušek, Filip ; Ječmen, Tomáš (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Glykoproteiny se běžně vyskytují v organismech a hrají významnou roli jak za fyziologického, tak patologického stavu. U glykoproteinů se na jednom glykosylačním místě mohou vyskytovat odlišné glykany a změna glykosylace proteinů může být projevem onemocnění. Díky tomu mohou být využity glykoproteiny v diagnostice jako markery. Pro analýzu glykoproteinů se často využívá jejich naštěpení na glykopeptidy, které jsou poté identifikovány. Hojně používanou metodou pro studium glykopeptidů je kapalinová chromatofrafie propojená s hmotnostní spektrometrií a pro separaci glykopeptidů je možné použít hydrofilní interakční chromatografii (HILIC). Tento typ chromatografie umožňuje separovat glykopeptidy na základě vlastností jak peptidu, tak navázaného glykanu. Prvním cílem práce bylo určení míry vlivu náboje peptidové páteře glykopeptidů při jejich separaci na HILIC. Pro tento účel byly použity kolony: Penta-HILIC a HILIC-B. Penta-HILIC obsahuje polyhydroxylovou stacionární fázi, zatímco stacionární fáze HILIC-B je tvořena silikagelem modifikovaným kladně nabitými aminopropylovými skupinami. Na obou kolonách byly separovány glykopeptidy IgG1 a IgG2. Pro určení míry vlivu náboje a hydrofobicty při separaci na HILIC-B byla provedena propionylace a esterifikace, při kterých došlo k eliminaci náboje na nabitých...
|
|
|
Vývoj nových tyrosin vázajících sond pro strukturní charakterizaci proteinů
Karpíšek, Michael ; Kukačka, Zdeněk (vedoucí práce) ; Talacko, Pavel (oponent)
Proteiny jsou základními stavebními kameny živých organismů. Jejich funkce je deter- minována jejich strukturou, a proto jejímu studiu je věnováno mnoho energie a pozornosti. Jednou z technik, která se při studiu struktury proteinů a biomolekul obecně používá, je technika chemického zesítění ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Ačkoli bylo již vyvinuto mnoho činidel, většina z nich selektivně váže jen několik aminokyselin, jako jsou lysin, cystein, či kyseliny asparagová a glutamová. V naší práci jsme se zaměřili na vývoj činidel kovalentního značení, které by mohly vázat na tyrosin. Na modelových proteinech byl studován vliv činidel obsahující ve své struktuře ester N-hydroxysukcinimidu či imidazol a to při různých pH přístupy shora dolů (top down) a zdola nahoru (bottom up). Získaná data naznačují, že studovaná činidla mají různou reaktivitu i specifitu. Činidla obsahující imidazolovou skupinu tyrosin modifikovala více, nicméně rozdíly byly malé a vazba na tyrosin nebyla selektivní.
|
|
|
Využití radikálového značení proteinů pomocí Togniho činidel ve strukturní biologii
Fojtík, Lukáš ; Kukačka, Zdeněk (vedoucí práce) ; Kolenko, Petr (oponent)
Metody strukturní proteomiky, mezi které se řadí iontová mobilita, chemické zesítění či kovalentní značení, lze zařadit mezi významné metody studia struktury biomolekul. Tyto metody v posledních dekádách významně přispěly k rozšíření našich znalostí o funkci, dynamice a molekulárních interakcích biomolekul a napomohly tak k pochopení důležitých biologických procesů v buňce. My jsme se rozhodli toto portfolio metod dále rozšířit, a to o přístup využívající fluoralkylové radikály generované Togniho činidly bez nutnosti použít laser. Jako modelové biomolekuly byly zvoleny proteinogenní aminokyseliny, proteiny ubiquitin, a apo- a holoformy myoglobinu. Radikály byly indukovány kyselinou askorbovou a terminovány nadbytkem tryptofanu. Analýza produktů radikálového značení byla prováděna hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením. V případě "Top down" analýzy byly testovány fragmentační techniky ETD, ECD-CID a v případě "Bottom up" byly proteiny štěpeny trypsinem a separovány na koloně s obrácenou fází spojenou s hmotnostním spektrometrem. V případě značení aminokyselin byly označeny všechny aromatické aminokyseliny a cystein. Následné mapování přístupnosti proteinového povrchu k rozpouštědlu fluoralkylovým radikálům přineslo strukturní informace, které jsou ve shodě se známou prostorovou strukturou...
|
|
|
Characterization of protein structures using chemical cross-linking and mass spectrometry.
Kukačka, Zdeněk ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Rozbeský, Daniel (oponent) ; Hernychová, Lenka (oponent)
Některé bílkoviny k plnění své funkce vyžadují přítomnost specifického ligandu, kofaktoru nebo prostetické skupiny. Vazba této specifické molekuly může v molekulách bílkovin způsobit konformační změny. V některých případech může charakterizace takovýchto konformačních změn představovat velmi náročný úkol. V předkládané práci je popsán nový přístup sloužící ke sledování těchto změn pomocí kombinace chemického zesítění a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením. Na modelovém systému, kterým byl zvolen protein kalmodulin, je ukázáno, že analýza pomocí izotopově značených síťovacích činidel umožnuje získat přehled o změnách struktury způsobených přítomností nebo nepřítomností ligandu. Byly rovněž popsány potenciální nedostatky metody, které tkví především v nedostatečné proteolýze proteinu. Tato nová metoda, která zároveň umožňuje kvantifikaci strukturních změn proteinů, byla použita spolu s dalšími technikami k charakterizaci neutrální trehalasy Nth1 v komplexu s proteinem Bmh1 (kvasinková forma proteinu 14-3-3). Výsledky odhalily, že vazba proteinu Bmh1 vyvolává přeskupení molekuly Nth1 se změnami především v tzv. "EF-hand" podobném motivu, který je nezbytný pro aktivační proces.
|
|
| |
|
|
Příprava mutantních forem cytochromu b5 s fotoreaktivními aminokyselinami a jejich síťování s vazebnými partnery
Landl, David ; Ječmen, Tomáš (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Cytochrom b5 plní funkci přenašeče elektronů v klinicky významném systému oxygenas se smíšenou funkcí (MFO systému). Tento systém se podílí na zvýšení hydrofility látek v první fázi biotransformace xenobiotik a na aktivaci nebo deaktivaci některých léčiv a karcinogenů. Cytochrom b5 ovlivňuje reakce katalyzované terminálními oxygenasami systému - cytochromy P450. Donory elektronů cytochromu b5 jsou NADH:cytochrom b5 reduktasa a NADPH:cytochrom P450 reduktasa Cílem této práce bylo ověřit, zda je možné pomocí metody foto-chemického zesítění fixovat transientní interakce mezi těmito proteiny. Takto získané kovalentní komplexy mohou být dále analyzovány pomocí hmotnostní spektrometrie a poskytují strukturní informace o vazebných místech proteinů. Pro účely foto-síťování byl připraven mutantní cytochrom b5 obsahující v sekvenci v pozici 41 foto-aktivovatelný analog methioninu. Protein jsme exprimovali ve 300 ml limitního média, ve kterém byl methionin nahrazen L-2-amino-5,5-azi-hexanovou kyselinou (foto-methionin), a použili k tomu auxotrofní kmen bakterií E. coli B834(DE3). Míra inkorporace nepřirozené aminokyseliny byla po 16 h exprese stanovena pomocí hmotnostní spektrometrie na přibližně 40 %. Izolací jsme získali celkem 15,4 nmol mutantního cytochromu b5 o koncentraci 76,8 µmol/l. Získaný...
|
|
|
Příprava DNA vazebné domény transkripčního faktoru FOXK2
Kobrle, Lukáš ; Kukačka, Zdeněk (vedoucí práce) ; Bělonožníková, Kateřina (oponent)
Transkripční faktory jsou specifické proteiny, které jsou schopny regulovat trankripci a které se na základě strukturních motivů dělí do jednotlivých rodin. Jednou z těchto rodin je i rodina FOX, do které se řadí i transkripční faktor FOXK2, jež byl předmětem studia této práce. Protein FOXK2 reguluje mnoho buněčných dějů včetně buněčné proliferace a metabolismu a má neméně důležitou roli při karcinogenezi, neboť jeho zvýšená exprese byla zaznamenána v případech rakoviny plic, jater a ledvin. V rámci této práce byla připravena DNA vazebná doména trakripčního faktoru FOXK2 rekombinantní expresí v buňkách Escherichia coli. Získaný protein byl poté purifikován a byla studována jeho interakce s DNA pomocí nativní hmotnostní spektrometrie.
|
host ::
RSS.