|
|
Změny metabolismu rostlin v důsledku fytoremediace léčiv
Polívková, Linda ; Bělonožníková, Kateřina (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
V důsledku lidské činnosti stoupá rychlost a množství, s jakými do životního prostředí vstupují nejrůznější polutanty. Mezi nimi mají důležitou roli léčiva a jejich metabolity, jejichž osud v přírodě zatím není zcela prozkoumán. Fytoremediace, jako alternativní metoda k tradičně zavedeným způsobům remediace odpadních vod a půd kontaminovaných polutanty, má stále vyšší potenciál stát se důležitým a ekologicky šetrným nástrojem pro obnovu a zachování životního prostředí. V této bakalářské práci byl sledován vliv léčiv buspironu, dextromethorfanu, ibuprofenu, kombinace dextromethorfanu a ibuprofenu, paroxetinu a sulpiridu na antioxidační systém kukuřice seté (Zea mays L., DKC 3969) kultivované in vitro v hydroponii za sterilních podmínek. V rostlinách kukuřice byla stanovena aktivita a izoenzymové složení peroxidas, které patří mezi klíčové složky antioxidačního systému. Množství celkových rozpustných proteinů v rostlinách bylo vlivem zmíněných léčiv ve většině případů sníženo. Naopak specifická aktivita celkových peroxidas, askorbátperoxidasy a guajakolperoxidasy byla ve většině případů zvýšena, a to nejvíce vlivem buspironu, sulpiridu a kombinace dextromethorfanu a ibuprofenu. Vliv daných farmak se projevil i změnami počtu a aktivit jednotlivých isoforem celkových volných peroxidas a...
|
|
|
Příprava a charakterizace proteinových konstruktů ke strukturní analýze acylační domény adenylát cyklázového toxinu z bakterie B. pertussis
Ryvola, Vojtěch ; Ječmen, Tomáš (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Černý kašel neboli pertuse je nakažlivé bakteriální onemocnění dýchacích cest způsobené bakterií B. pertussis. Navzdory velké proočkovanosti populace ve vyspělých zemích, patří černý kašel k nejrozšířenějším onemocněním, kterému lze předcházet očkováním. Bakterie B. pertussis produkuje celou řadu toxinů, které usnadňují osídlení a pomnožení bakteriálních buněk na hostitelském řasinkovém epitelu horních cest dýchacích. Jedním z těchto toxinů je adenylát cyklázový toxin, který je z bakteriálních buněk uvolňován pomocí sekrečního aparátu typu I a po jeho vápníkem-indukovaném sbalení je schopen dopravit přes cytoplasmatickou membránu hostitelských buněk svoji N-koncovou adenylát cyklázovou doménu, která po interakci s cytozolickým kalmodulinem katalyzuje přeměnu adenosintrifosfátu (ATP) na cyklický adenosinmonofosfát (cAMP). Vysoké hladiny cAMP vedou následně k poruchám buněčné signalizace a k zásadnímu omezení baktericidních funkcí fagocytujících buněk. Cílem této bakalářské práce bylo připravit a charakterizovat 'hybridní' proteinové konstrukty, které se skládají z C-koncové části acylační domény a N-koncové části RTX domény (v pozicích 881-1038 a 881-1047) napojené na C-koncovou část RTX domény (v pozici 1562-1681) nesoucí strukturní informaci pro inicializaci správného sbalení proteinové molekuly....
|
|
|
Modelování interakcí cytochromů P450 s flavodoxinem
Culka, Martin ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Cytochromy P450 jsou různorodá skupina hemových enzymů vyskytujících se u vět- šiny organismů na Zemi. U lidí zasahují např. do metabolismu cizorodých látek, bakterie jsou schopné díky nim metabolizovat různé hydrofobní substráty. Obecnou reakcí kata- lyzovanou cytochromy P450 je monooxygenace, tedy vnesení jednoho atomu z molekuly kyslíku do substrátu a redukce druhého za vzniku vody. Pro redukci kyslíku je třeba dodávat elektrony, jako donor elektronů u eukaryot obvykle slouží NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasa či cytochrom b5, u bakterií však donorem elektronů bývají malé FeS proteiny a flavoproteiny Již dříve bylo ukázáno, že bakteriální donor elektronů fla- vodoxin je schopen dodávat elektrony některým lidským cytochromům P450 in vitro. V této práci jsem se snažil ověřit hypotézu, že flavodoxin je zodpovědný za redukci vybraných lidských (1A2, 2A6, 2A13, 2C9, 2C19, 3A4) a bakteriálních (101A1 a 176A1) cytochromů P450 heterologně exprimovaných v buňkách Escherichia coli. Ke studiu byly použity techniky molekulového modelování. Byla navržena sada možných orientací komplexu jednotlivých cytochromů P450 s flavodoxinem metodou řízeného "dockingu a následně byla ověřena stabilita těchto komplexů řízenou disociací. Byly vybrány nejstabilnější orientace pro každý cytochrom P450, ty byly dále optimalizovány...
|
|
|
Přiřazení rezonančních frekvencí atomům proteinové páteře myšího proteinu Nkrp1c
Nelic, Dominik ; Chmelík, Josef (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
Protein Nkrp1c je receptor na povrchu myších přirozeně zabíječských buněk (natural killer cells) imunitního systému, který patří do rodiny C-lektin receptorů. Tyto buňky vytvářejí vrozenou imunitu proti nádorům či patogenům před vznikem protilátek. Určení 3D struktury proteinů je často klíčem pro pochopení funkce proteinu na molekulární úrovni. Jednou z možností, jak určit strukturu proteinů na atomární úrovni, je nukleární magnetická rezonance. Náplní této bakalářské práce bylo vyhodnocení několika již naměřených spekter a přiřazení rezonančních frekvencí atomů peptidové páteře potřebných pro získání dat na predikci sekundární struktury pro protein Nkrp1c, který byl připravený rekombinantní expresí. K vyhodnocení naměřených spekter byl využit program Sparky. Samotná predikce sekundární struktury proteinu Nkrp1c byla provedena programy Talos+ a PSIPRED. Získané výsledky byly porovnány s již publikovaným homologním modelem receptoru proteinu Nkrp1c. Klíčová slova: NMR proteinu, Nkrp1c
|
|
|
Protein chemistry and mass spectrometry in biochemical research
Pompach, Petr ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent) ; Kovářová, Hana (oponent)
Protein chemistry and mass spectrometry in biochemicul research Petr Pompach Ph. D. Thesis Department of Biochemistry Faculty of Science Charles University Supervisor: Doc. RNDr. Karel Bezouška, CSc. Prague 2006 tEia*iiitg;;tiBiÉ (n OO oO O\ O\ C.l C.l .+ : : : : :ÉGlc.l c.: Ý l.) a z t-r (J Fl E) lra J a U z a Fr tl5 a Fr zr\J) alai P.: ai a - Lr o L d a (|i iť r h t) o() r a a q C) ! - H F (n F íi a o) O a X, o >. C) o .l I +i oL o -O o o l.r U) N z oo - O o I L a Li +i vi ol Ei!t ,ql -l E 3a (n z E F a F z F z U pg ť: šé3; Ei ĚE$áE€EÉEáiz E ÉĚ E Ě s E ; u ; ó =-E5Ě:gd:'i = t Ei giĚg;;:1lV)iĚggĚgEsáEĚi* E Ě=;Éía:š;Éť E É!řěEEEFgg : ií€gáŤÉ5 ž:::š;;i : zi:€ i=ts€ĚiĚišĚÉiš;š5ĚiE.:. = = € .T ŽlĚE g;t$jíigggřEE iuEái E :É€šáĚ g;iÉ{Ě;ítÉÉF€Ě E iĚĚĚi ; š;šš!iiE řě E ši gE ig Ý E giĚE šgig;išiš::gígFĚi+g s E *'suĚšěĚ Ěie *Ěá, uE trE s'' -k*-=a.*:.* g: EPE€'šEEř€9 ěÍ.E ;š e::E;;áe;iÉgřšiE řĚt.E*E$*eE=$[:gř.v :IEF€=áfrE;='2E-ď ?! : g"HEu.:i=ĚE€;ÉE€ř€ Eš,*éEě9t.F;EE.Ě., ťiEEEE*ě:iiEĚgĚ:Éžáx;šš ř 5šEtsť uE.E.= e *n á:; € žEř: € ÉE.: i= ř-g p; i ĚĚ;: € i íEĚ = Hi;2E É*Ě u, Ě y ?' : 6 ě ř ; fij .: .c F=E;-sg&,Ě7Éď€3E€€ -i€E.E =:Í E=bÉ::ň !B:,: E t šáč š 3e = Ě l E ř f L Ei:í:9:*q;€gq3:;:.E: ťšÉI: Ě i ?E Ě ; Éi É.EE E EEE :!rEě45BEE EE.= €Eě íEEra-vĚ=3ň €.E3 iillťlgtššgtgi;g;ggiĚš; iáágá9 $*i;Ě:E; -Eás;t;É$ \o Ěi gi...
|
|
|
Studium extracelulární části myšího receptoru Nkr-p1b přirozených zabíječských buněk pomocí NMR
Skála, Kristián ; Chmelík, Josef (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
Protein Nkr-p1b je povrchový receptor cytotoxických NK buněk, který zprostředkovává inhibiční signál vůči buňkám tělu vlastním. V rámci této práce byla pomocí rekombinantní exprese v buňkách E. coli připravena ligand vazebná doména myšího proteinového receptoru Nkr-p1b (mNkr-p1b LBD), která byla následně použita pro NMR strukturní analýzu. Pomocí třech různých metod (CD, PSIPRED a TALOS) bylo určeno zastoupení sekundárních struktur v molekule proteinu. Získané procentuální zastoupení sekundárních struktur přibližně odpovídá struktuře CTLD domény, která je důležitá pro vazbu ligandu, a tedy funkci receptoru Nkr-p1b. Daný protein se podařilo připravit ve formě vhodné pro NMR experimenty. Na základě dat získaných analýzou NMR spekter byl vytvořen předběžný model struktury proteinu mNkr-p1b LBD. Pro přesnější učení 3D struktury však ještě bude v dalších fázích potřeba vyhodnotit další NMR spektra, a upřesnit tak polohu jednotlivých atomů v molekule proteinu. Rozluštění struktury LBD domény proteinu mNkr-p1b by mohlo pomoci lépe pochopit komplexní mechanizmus aktivace NK buněčné cytotoxické aktivity, a tím přispět k jejímu řízenému využití jako terapeutika proti některým virovým a nádorovým onemocněním.
|
|
|
N-oxidy morfinanových alkaloidů
Palušák, Martin ; Dračínská, Helena (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Morfinanové alkaloidy patří mezi důležité látky při léčbě a potlačení bolesti. Pochopení účinku těchto látek je důležité pro zdokonalení léčby pomocí těchto alkaloidů, například při syntéze nových derivátů se zvýšenými účinky. Tato práce má za cíl shrnout dosavadní znalosti o těchto látkách od jejich biosyntézy v rostlinách, až po celkový účinek na organismus. Cílem praktické části práce je pak určit relativní konfiguraci morfinanových N- oxidů vzniklých in situ oxidací výchozích alkaloidů pomocí NMR spektroskopie a molekulového modelování. Pomocí NMR spektroskopie byly určeny relativní konfigurace oxidovaných i neoxidovaných forem morfinu, kodeinu a tebainu a zjištěn poměr vzniklých N-oxidů in situ. Tyto výsledky byly porovnány s kvantově chemickými výpočty provedenými metodou DFT. Porovnáním obou metod byla ověřena spolehlivost zvolené výpočetní metody. Klíčová slova: NMR spektroskopie, morfin, kodein, tebain, N-oxidy, metabolismus alkaloidů
|
|
|
Příprava rozpustné formy myšího NKR-P1A proteinu pro NMR analýzu
Skála, Kristián ; Chmelík, Josef (vedoucí práce) ; Adámková, Lyubina (oponent)
Přirození zabíječi (NK buňky) patří mezi lymfocyty a funkčně jsou definováni jako buňky schopné cytotoxicky usmrtit cílové buňky bez předchozí senzibilizace. Jednou z rodin povrchových receptorů NK buněk je rodina NKR-P1. Členové této rodiny patří mezi receptory C-lektinového typu, přičemž některé plní funkci aktivační a jiné inhibiční. Rozpustná forma myšího proteinu Nkr-p1a je izoformou aktivačního receptoru Nkr-p1a. V jeho aminokyselinové sekvenci chybí významná část transmembránové domény, proto je vysoká pravděpodobnost jeho výskytu v cytoplazmě. Tato práce se zaměřuje na optimalizaci podmínek produkce rozpustné formy myšího Nkr-p1a proteinu v bakteriálním kmeni E. coli BL21(DE3) Gold, jeho izolaci ve formě inkluzních tělísek a purifikaci pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Byla optimalizována koncentrace induktoru exprese, doba a teplota produkce. Cílem optimalizace pracovního postupu je jeho využití pro přípravu izotopově značeného proteinu pro strukturní studium metodou nukleární magnetické rezonance.
|
|
|
Kooperativita složek systému cytochromů P450 a ovlivnění metabolismu léčiv a karcinogenů
Holý, Petr ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Systém oxidas se smíšenou funkcí (MFO systém) hraje důležitou roli v metabolismu mnoha endogenních látek a xenobiotik (např. karcinogenů, léčiv). Membránové hemoproteiny nazývané cytochromy P450 jsou zásadní složkou tohoto systému. Reakce katalyzované cytochromy P450 jsou ovlivňovány působením jiného proteinu MFO systému, a to cytochromem b5 (cyt b5). Mechanismus, jakým cyt b5 působí, ještě nebyl zcela objasněn. Jednou z možností studia této protein-proteinové interakce je metoda kovalentního síťování. Záměnou methioninu ve struktuře cyt b5 za jeho foto-aktivovatelný analog (foto-methionin) je možné připravit analog cyt b5 (foto-cyt b5), který po aktivaci UV zářením kovalentně váže cytochrom P450 v membránovém prostředí. Tato práce se zabývá expresí a izolací rekombinantního analogu cyt b5 s pouze jednou pozicí pro methionin (96) v primární struktuře proteinu a jeho substitucí za foto-methionin. Protein byl purifikován s výtěžkem 6 mg na 1 l bakteriální suspenze. Analýza hmotnostní spektrometrií (MALDI-TOF/TOF) ukázala, že methionin byl v sekvenci substituován foto-reaktivním analogem z asi 30 % (pokrytí sekvence 77 %). Foto- cyt b5 byl použit k fixování transientní protein-proteinové interakce s cytochromem P450 2B4 (CYP2B4). Foto-cyt b5 byl rekonstituován v lipidovém systému s CYP2B4 a...
|
|
|
Modelování interakcí cytochromů P450 s flavodoxinem
Culka, Martin ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Cytochromy P450 jsou různorodá skupina hemových enzymů vyskytujících se u vět- šiny organismů na Zemi. U lidí zasahují např. do metabolismu cizorodých látek, bakterie jsou schopné díky nim metabolizovat různé hydrofobní substráty. Obecnou reakcí kata- lyzovanou cytochromy P450 je monooxygenace, tedy vnesení jednoho atomu z molekuly kyslíku do substrátu a redukce druhého za vzniku vody. Pro redukci kyslíku je třeba dodávat elektrony, jako donor elektronů u eukaryot obvykle slouží NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasa či cytochrom b5, u bakterií však donorem elektronů bývají malé FeS proteiny a flavoproteiny Již dříve bylo ukázáno, že bakteriální donor elektronů fla- vodoxin je schopen dodávat elektrony některým lidským cytochromům P450 in vitro. V této práci jsem se snažil ověřit hypotézu, že flavodoxin je zodpovědný za redukci vybraných lidských (1A2, 2A6, 2A13, 2C9, 2C19, 3A4) a bakteriálních (101A1 a 176A1) cytochromů P450 heterologně exprimovaných v buňkách Escherichia coli. Ke studiu byly použity techniky molekulového modelování. Byla navržena sada možných orientací komplexu jednotlivých cytochromů P450 s flavodoxinem metodou řízeného "dockingu a následně byla ověřena stabilita těchto komplexů řízenou disociací. Byly vybrány nejstabilnější orientace pro každý cytochrom P450, ty byly dále optimalizovány...
|
host ::
RSS.