|
|
Site-directed mutagenesis of human cytochromes P450 family 1 and their interacting partners
Milichovský, Jan ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Befekadu, Asfaw (oponent) ; Souček, Pavel (oponent)
Cytochromy P450 jsou rozsáhlou skupinou proteinů metabolizujících široké množství substrátů. Řada z nich se významně podílí na metabolismu léčiv či jiných xenobiotik včetně řady chemických karcinogenů. Hemoprotein cytochrom b5 je jedno-elektronový přenašeč elektronů spolupracující s NADPH:cytochrom P450 reduktasou a NADH:cytochrom b5 reduktasou 3, který je spjatý s metabolismem zprostředkovaným cytochromy P450. Cytochrom b5 je schopen prostřednictvím modulace aktivity cytochromů P450 ovlivňovat metabolismus řady látek. Cílem disertační práce bylo využít místně cílenou mutagenezi cytochromů P450 rodiny 1 k lepšímu porozumění mechanismu jejich nitroreduktasové aktivity. Dále byla studována interakce cytochromu b5 s cytochromy P450 podrodiny 1A pomocí místně cílené mutageneze jejich předpokládaného kontaktního rozhraní. V rámci práce byly také, za použití kombinace experimentu a teoretických přístupů, studovány rozdíly v redukci lidských cytochromů P450 v intaktních bakteriálních buňkách během jejich heterologní exprese. Z výsledků vyplývá, že nitroreduktasová aktivita CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 je zprostředkována hydroxylovou skupinou v aktivním místě a jejím zavedením lze u CYP1B1 artificiálně vyvolat nitroreduktasovou aktivitu. Pomocí mutageneze byly také identifikovány aminokyseliny, které se...
|
|
|
Teoretická studie enzymů spojených s procesem karcinogeneze: DNA polymerázy β a cytochromů P450
Jeřábek, Petr ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Ettrich, Rüdiger (oponent)
Disertační práce přispěla k poznání funkce dvou typů enzymů participujících na procesech karcinogeneze, DNA polymerázy (pol ) a cytochromů P450 (CYP). Pol je součástí opravného systému DNA "Base Excision Repair" (BER), kde tento enzym provádí vkládání nového nukleotidu do řetězce DNA na základě párování s bází templátového řetězce. Mutované formy pol byly nalezeny v 30% lidských tumorů, což ukazuje na její důležitou úlohu v procesu karcinogeneze. V disertační práci byly studována schopnost pol rozlišovat mezi "správnou" a "špatnou" bází v průběhu jejího vkládání do DNA, tzv. "fidelitu" (přesnost přiřazení "správného" nukleotidu, v duchu pravidel komplementarity). K tomu byly využity metody počítačového modelování, vhodné pro porovnání energetických rozdílů mezi komplexy obsahující "správnou" a "špatnou" bází. Použita byla metoda výpočtu volných energií LRA. Výsledky signalizují, že jeden z hlavních příspěvků k celkové "fidelitě" pol spočívá v lepší stabilizaci tranzitního stavu nukleofilní substituce "správné" báze, oproti "špatné". Tento rozdíl přispívá 80-ti násobkem k celkové "fidelitě"¨ tohoto enzymu. Identifikovány byly i strukturní prvky, které jsou důležité pro "fidelitu" pol i katalýzu tohoto enzymu. Pro studium sledující vliv mutací na "fidelitu" pol byly použity metody FEP...
|
|
|
Studium role vybraných izoforem cytochromu P450 v cytostatické rezistenci na úrovni apoptózy
Moriová, Magdalena ; Hofman, Jakub (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Magdalena Moriová Školitel: RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. Název diplomové práce: Studium role vybraných izoforem cytochromu P450 v cytostatické rezistenci na úrovni apoptózy Cytostatická rezistence je jednou z nejzáludnějších terapeutických překážek v onkologické léčbě. Vedle mechanizmů farmakodynamických hrají v lékové rezistenci důležitou roli též faktory farmakokinetické. Mezi takové mechanizmy zřejmě patří i enzymatická transformace účinné látky na neaktivní metabolit v nádorových buňkách, důkazy o zapojení enzymů ve farmakokinetické rezistenci jsou však dosud veskrze pouze nepřímé nebo zatížené interferenčními elementy. Za využití komparativních experimentů v HepG2 liniích s/bez overexprese CYP3A4 jsme se zaměřili na zhodnocení role tohoto klinicky důležitého enzymu v rezistenci vůči docetaxelu. Metodicky se jednalo o stanovení indukce apoptózy (aktivace kaspáz 3/7, 8 a 9) pomocí komerčních luminiscenčních kitů. Naše výsledky poukazující na signifikantní zapojení enzymu CYP3A4 v omezení účinnosti docetaxelu v intervalu 48 h, přičemž v časnějších intervalech se tento závěr nepotvrdil. Tato zjištění výborně korelují s výsledky našich předchozích studií zaměřených na proliferační úroveň. Získané...
|
|
|
Role mikroRNA v regulaci jaterních enzymů metabolizujících léčiva
Sedlmajer, Štěpán ; Smutný, Tomáš (vedoucí práce) ; Matoušková, Petra (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Student/ka: Štěpán Sedlmajer Školitel: PharmDr. Tomáš Smutný, Ph.D. Název diplomové práce: Role mikroRNA v regulaci jaterních enzymů metabolizujících léčiva Játra jsou hlavním biotransformačním orgánem v těle. Cytochromy P450 a konjugační enzymy jsou nezastupitelné enzymy v metabolismu léčiv a dalších xenobiotik. V poslední době narůstá poznání o post-transkripční regulaci těchto enzymů pomocí molekul mikroRNA. MikroRNA jako epigenetické regulátory exprese se většinou vážou na zcela nebo částečně komplementární sekvence v 3'UTR (3' untranslated, nepřekládaných) regionech mRNA molekul. MikroRNA mají podíl na interindividuální variabilitě v expresi a aktivitě metabolizujících enzymů. Objasnění jejich role a mechanismů působení může přispět k vývoji nových léčiv a personalizaci farmakoterapie. Práce shrnuje dosavadní vybrané poznatky o regulaci převážně jaterních cytochromů P450 a konjugačních enzymů prostřednictvím mikroRNA. Popsán je také vliv RNA editací, jednonukleotiových polymorfismů a pseudogenů.
|
|
|
Vliv pH a dalších faktorů na metabolické přeměny tyrosinkinasových inhibitorů.
Čillíková, Olívia ; Indra, Radek (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
Cílená protinádorová terapie je novodobým efektivním přístupem k léčbě nádorových onemocnění. Tento typ léčby zahrnuje několik skupin protinádorových léčiv. Druhou nejčastěji využívanou skupinou cílených chemoterapeutik jsou inhibitory tyrosinkinas. Jedná se o nízkomolekulární látky, které cíleně zasahují do určitých signalizačních drah nádorové buňky a tím inhibují její růst, proliferaci a angiogenezi. Zástupci této skupiny léčiv jsou např. vandetanib a sunitinib. Vandetanib se primárně využívá k léčbě medulárního karcinomu štítné žlázy a sunitinib byl schválen pro léčbu gastrointestinálního stromálního tumoru a pro léčbu pokročilého renálního karcinomu. Předkládaná diplomová práce se zabývá vlivem pH a teploty na in vitro metabolismu sunitinibu a vandetanibu pomocí enzymů v první fázi biotransformace. Při experimentech byly použity různé jaterní mikrozomy z premedikovaných a kontrolních potkanů. Pro porovnání byly využity lidské a potkaní rekombinantní cytochromy P450. Primárním účelem experimentů bylo nalezení experimentálního pH a teplotního optima jejich in vitro metabolismu. V rámci těchto experimentů byl zkoumán i vliv pH a teploty na samotná léčiva a jejich stabilitu. Ovlivnění metabolismu vandetanibu a sunitinibu pomocí pH a teploty bylo analyzováno pomocí vysokoúčinné kapalinové...
|
|
|
Vliv protinádorového léčiva cabozantinibu na aktivitu cytochromů P450
Slobodníková, Eva ; Dračínská, Helena (vedoucí práce) ; Václavíková, Radka (oponent)
Cabozantinib je protinádorové léčivo používané zejména pro léčbu karcinomu štítné žlázy a ledvinových buněk. Řadí se mezi nízkomolekulární selektivní inhibitory tyrosinkinas. Tyrosinkinasy mají klíčovou roli při přenosu signálů a regulaci řady buněčných procesů, jako je růst, diferenciace a proliferace. Změny v tyrosinkinasových dráhách jsou spojeny se vznikem a progrese nádorů, kde dochází k jejich nekontrolovatelnému růstu. Inhibitory tyrosinkinas působí na tyrosinkinasové receptory, čímž zabraňují dělení nádorových buněk a zároveň zpomalují progresi nádorového onemocnění. Jelikož cabozantinib, stejně jako většina klinicky používaná léčiva, podléhá metabolismu cytochromy P450, může dojít k nežádoucím lékovým interakcím, které mají za následek změnu farmakokinetiky podávaných léčiv, a následné snížení účinnosti těchto léčiv. V této diplomové práci byl sledován účinek cabozantinibu na aktivitu hlavních enzymů I. fáze biotransformace xenobiotik, cytochromů P450, in vitro. Studován byl účinek na aktivitu potkaních i lidských izoforem cytochromů P450, které se účastní metabolismu xenobiotik. Izoformy CYP byly převážně inkubovány s cabozantinibem o dvou koncentracích; 10 µM a koncentraci odpovídající koncentraci substrátu ve specifické markerové reakci. Výsledky prokázaly inhibiční vliv cabozantinibu u...
|
|
|
Metabolismus mitotického inhibitoru BTB-1 enzymy první fáze biotransformace
Vančurová, Kateřina ; Indra, Radek (vedoucí práce) ; Martináková, Lenka (oponent)
Onemocnění rakovinou je stále jedno z nejčastějších úmrtí na světě, proto je třeba vyvíjet nová léčiva a tím zastavit či zpomalit tuto nemoc. V poslední době dochází k obrovskému rozmachu ve vývoji léčiv. Mezi cytostatika, která jsou stále hojně využívaná, patří také skupina mitotických inhibitorů, jejichž cílem je inhibovat mitózu. Zástupcem mitotického inhibitoru je malá nově objevená molekula BTB-1. Tato molekula zprostředkovává reverzibilní inhibici molekulárního motoru Kif18A, který hraje důležitou roli při buněčném dělení. V první části předkládané bakalářské práce byla vytvářena vhodná metoda pro stanovení BTB-1 pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie a následně byla ověřována její citlivost. Dále bylo hledáno vhodné extrakční činidlo. Ve druhé části bakalářské práce byl studován metabolismus BTB-1 za použití mikrosomálního systému nepremedikovaných (kontrolních) potkanů a potkanů premedikovaných různými induktory cytochromu P450. Následně byla studována časová závislost přeměny BTB-1 pomocí mikrosomálního systému premedikovaných potkanů. Rovněž byl studován vliv různých koncentrací BTB-1 na jeho metabolismus za použití mikrosomálního systému premedikovaných potkanů. Dále byl metabolismus této nové molekuly studován za použití cytosolárních systémů vyizolovaných z jater, plic a ledvin...
|
|
|
Aktivita cytochromů P450 1A1, 1A2 a 3A4 exprimovaných v eukaryotních a prokaryotních systémech
Indra, Radek ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Mizerovská, Jana (oponent)
Cytochromy P450 (CYP) tvoří superrodinu hemových proteinů, jenž je široce rozšířená v přírodě. Jsou důležité pro metabolismus širokého spektra substrátů a katalyzují řadu chemických reakcí. Hrají centrální roli v metabolismu chemoterapeutik (léčiv). Mají také schopnost aktivovat některé protinádorové činidla. Ellipticin, alkaloid nalezený v rostlinách čeledi Apocynaceae, je příkladem takového substrátu cytochromů P450. V práci byla testována efektivita lidských rekombinantních cytochromů P450 exprimovaných v eukaryotickém a prokaryotickém expresním systému, jmenovitě v SupersomechTM , což jsou mikrosomy izolované z hmyzích buněk transfekovaných baculovirem nesoucím cDNA lidských CYP1A1, 1A2 a 3A4 s NADPH:cytochrom P450 reduktasou nebo v Bactosomech, které jsou membránovou frakcí buněk E. coli transfekovaných cDNA stejných lidských cytochromů a NADPH:cytochrome P450 reduktasou, pro oxidaci jejich markerových substrátů a ellipticinu. Cytochrom b5, fakultativní složka systému oxidas se smíšenou funkcí, která metabolizuje xenobiotika, byl také exprimován v některých systémech. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že lidské CYP1A1, 1A2 nebo 3A4 exprimované v prokaryotickém nebo eukaryotickém systému oxidují své markerové substráty (EROD pro CYP1A1/2, MROD pro CYP1A2 a 6β-hydroxylaci testosteronu pro...
|
|
|
Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Při metabolismu xenobiotik a endogenních látek se uplatňuje monooxygenasový systém, jehož součástí je i cytochrom b5 participující na katalytické činnosti cytochromů P450 (CYP). Mechanismus působení cytochromu b5 v tomto souboru enzymů však nebyl doposud zcela objasněn. Předpokládá se, že se buď přímo podílí na přenosu elektronů v rámci monooxygenasového systému, nebo může alostericky působit na konformaci CYP. Proto je důležité získat co nejčistší apoformu cytochromu b5, která není schopna přenosu elektronů, a dále studovat vliv této nehemové formy cytochromu b5 na činnost CYP. Získané výsledky pak mohou přispět k poznání mechanismu působení cytochromu b5. V průběhu této práce byla provedena transformace bakteriálního kmene buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold expresním vektorem pET22b, který nesl geny pro mikrosomální a erytrocytární formu cytochromu b5. Za účelem produkce vysokého podílu apoproteinové formy byla heterologní exprese cytochromu b5 indukována vyšším přídavkem IPTG a byla provedena při 37řC. Tato bakalářská práce se pak zabývá zejména purifikací jak mikrosomální, tak i erytrocytární formy cytochromu b5 a to hlavně jeho apoformy. Jelikož však při expresi dochází vždy ve větší či menší míře i k produkci hemové formy cytochromu b5, byla i ta izolována. Holo- a apoproteinová forma...
|
|
|
Izolace a charakterizace mikrosomální frakce houby Pleurotus ostreatus a její úloha v degradaci 17α-ethinylestradiolu
Valášková, Petra ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent)
Syntetický hormon 17α-ethinylestradiol (EE2), který je součástí hormonálních antikoncepčních pilulek, byl identifikován jako hlavní složka tzv. endokrinně disruptivních látek (EDc). EDc jsou látky, které napodobují svým účinkem přirozené hormony. V posledních letech se jejich množství zejména v podzemních a povrchových vodách značně zvyšuje, což má negativní vliv na hormonální systém zejména vodních organismů. Jelikož není snadné tyto látky z životního prostředí běžnými technikami odstranit, hledají se možnosti jejich biodegradace. Slibné biodegradační schopnosti vůči mnoha polutantům vykazují houby bílé hniloby, které v přírodě rozkládají lignin. Tyto houby disponují širokou škálou nespecifických extracelulárních a intracelulárních enzymů, které ve zmíněných degradacích hrají významnou roli. Tato bakalářská práce byla zaměřena na studium zástupce hub bílé hniloby, houbu Pleurotus ostreatus, a zejména degradační potenciál jeho intracelulárních enzymů při biodegradaci EE2. Nejprve byla ověřena schopnost houby Pleurotus ostreatus degradovat EE2 in vivo. Během 48 hodinové inkubace došlo k odbourání až 95,5 % EE2. Role cytochromů P450 (CYP) při metabolismu EE2 však tímto experimentem nebyla potvrzena, jelikož inhibitor CYP 1-aminobenzotriazol (1-ABT) nesnižoval účinnost degradace. V další fázi...
|
host ::
RSS.