|
|
Posouzení efektivity laboratorních testů pro stanovení exokrinní funkce pankreatu
Šubčíková, Lenka ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Milichovský, Jan (oponent)
Chronická pankreatitida je velmi komplexní onemocnění s obtížnou diagnostikou. V současné době je diagnostika a klasifikace chronické pankreatitidy založena hlavně na zobrazovacích metodách. V této práci byly porovnávány výsledky dvou nepřímých testů exokrinní pankreatické funkce s rozdílným uspořádáním. Byla stanovována elastáza 1 ve stolici ELISA metodou s monoklonální protilátkou, jako představitel jednoduchého screeningového testu a dynamika a kinetika exokrinní pankreatické sekrece pomocí dechového testu s 13 C značeným substrátem. Testy byly prováděny na skupině čtyř dobrovolníků do dobu půl roku s frekvencí jeden měsíc. Byla sledována vzájemná variabilita a korelace prováděných testů. Dále byla statisticky zpracována data z těchto testů u pacientů s podezřením na chronickou pankreatitidu poskytnutá v anonymizované formě pracovištěm Ústavu laboratorní biochemie a laboratorní diagnostiky. Prokázali jsme, že nepřímé funkční testy a stanovení pankreatických enzymů spolu nekorelují a proto oba tyto laboratorní testy mají svůj specifický význam především v diagnostice exokrinni pankreatické nedostatečnosti.
|
|
|
Heterologní exprese a izolace lidských isoforem cytochromů P450 1A1/2
Milichovský, Jan ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent)
Cytochromy P450 tvoří velmi početnou rodinu hemoproteinů. Řada z nich je zodpovědná za metabolismus endogenních látek, ale velmi významnou roli hrají i v detoxifikaci cizorodých látek (xenobiotik) a také v aktivaci některých z nich na reaktivní karcinogeny tvořící kovalentní adukty s DNA a zvyšující vnitrobuněčný oxidativní stres. Pro cytochromy P450 je typická nízká substrátová specifita, takže jeden enzym může oxidovat desítky až stovky různých substrátů. Mezi enzymy metabolizující planární aromatické sloučeniny (např. polycyklické aromatické uhlovodíky, azobarviva atd.) patří cytochrom P450 1A1, a dále cytochrom P450 1A2, který vykazuje podobnou substrátovou specifitu, ale preferuje mírně bazické aromáty, a mezi jinými metabolizuje například kofein. Tato práce se zabývá (i) přípravou expresních vektorů kódující geny lidských forem cytochromů P450 1A1 a 1A2, (ii) heterologní expresí těchto proteinů a (iii) izolací těchto lidských forem cytochromu P450. V rámci práce byly geny kódující oba proteiny proteiny upraveny a přeneseny ze starších vektorů do vysoce účinných expresních plasmidů pET- 22b. Jelikož však exprese v nových plasmidech neposkytovala nativní protein, byly připraveny expresní vektory s využitím původního expresního plasmidu pCW, které nesly upravený gen cytochromu P450 1A2. Kvůli...
|
|
| |
|
|
Příprava expresních vektorů pro receptor NKp30 a jeho ligandy B7-H6 a BAG-6
Pažický, Samuel ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Milichovský, Jan (oponent)
NK buňky, buňky neadaptivního imunitního systému, jsou schopny za pomoci celé řady inhibičních a aktivačních receptorů rozeznat především virem infikované a nádorové buňky a následně je eliminovat. Pro NKp30, aktivační receptor NK buněk ze skupiny receptorů NCR (Natural Killer Cell Receptors), byla v poslední době identifikována několik ligandů, mezi které patří také membránový protein B7-H6 exprimovaný na nádorových buňkách a BAG-6, jaderný protein se širokým spektrem funkcí. Cílem mé bakalářské práce bylo připravit expresní vektory kódující receptor NKp30 a jeho ligandy B7-H6 a BAG-6, které by umožňovaly produkovat tyto proteiny v expresním systému HEK293. Klíčová slova: NK buňka, plasmid, receptor, NKp30, B7-H6, BAG-6
|
|
|
Molekulární mechanismy indukce programované buněčné smrti v nádorových buňkách.
Fenclová, Tereza ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Milichovský, Jan (oponent)
Nádorová onemocnění jsou v dnešní době třetí nejčastější příčinou úmrtí (20 % všech úmrtí). Proto je důležité najít nové způsoby jak nádorové buňky účinně a specificky likvidovat a nejslibnější cestou je cílená terapie. Jedním z nejčastěji deregulovaných protoonkogenů v nádorových buňkách je C-MYC, což ho předurčuje jako efektivní cíl léčby. Vývoj takovýchto cílených účinných látek je ale velmi nákladný, proto jsou v této práci zkoumány přírodní látky, které byly používány pro léčbu nádorových onemocnění už ve starověké Číně. V této práci jsou zkoumány látky shikonin, cnicin a artemisinin. Výsledky ukazují, že shikonin indukuje apoptosu nádorových buněk cestou snížení exprese C-MYC a aktivací tumor supresorové MST1 kinasy. Cnicin také snižuje expresi C-MYC, ale MST1 aktivuje pouze slabě. Artemisinin, na druhou stranu, expresi C-MYC zvyšuje a MST1 neaktivuje, indukuje tedy apoptosu nádorových buněk zcela jiným mechanismem.
|
|
|
Cílená mutageneze ve studiu lidských cytochromů P450 rodiny 1 a jejich interakčních partnerů
Milichovský, Jan
Cytochromy P450 jsou rozsáhlou skupinou proteinů metabolizujících široké množství substrátů. Řada z nich se významně podílí na metabolismu léčiv či jiných xenobiotik včetně řady chemických karcinogenů. Hemoprotein cytochrom b5 je jedno-elektronový přenašeč elektronů spolupracující s NADPH:cytochrom P450 reduktasou a NADH:cytochrom b5reduktasou 3, který je spjatý s metabolismem zprostředkovaným cytochromy P450. Cytochrom b5 je schopen prostřednictvím modulace aktivity cytochromů P450 ovlivňovat metabolismus řady látek. Cílem disertační práce bylo využít místně cílenou mutagenezi cytochromů P450 rodiny 1 k lepšímu porozumění mechanismu jejich nitroreduktasové aktivity. Dále byla studována interakce cytochromu b5 s cytochromy P450 podrodiny 1A pomocí místně cílené mutageneze jejich předpokládaného kontaktního rozhraní. V rámci práce byly také, za použití kombinace experimentu a teoretických přístupů, studovány rozdíly v redukci lidských cytochromů P450 v intaktních bakteriálních buňkách během jejich heterologní exprese. Z výsledků vyplývá, že nitroreduktasová aktivita CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 je zprostředkována hydroxylovou skupinou v aktivním místě a jejím zavedením lze u CYP1B1 artificiálně vyvolat nitroreduktasovou aktivitu. Pomocí mutageneze byly také identifikovány aminokyseliny, které se...
|
|
|
Cílená mutageneze ve studiu lidských cytochromů P450 rodiny 1 a jejich interakčních partnerů
Milichovský, Jan
Cytochromy P450 jsou rozsáhlou skupinou proteinů metabolizujících široké množství substrátů. Řada z nich se významně podílí na metabolismu léčiv či jiných xenobiotik včetně řady chemických karcinogenů. Hemoprotein cytochrom b5 je jedno-elektronový přenašeč elektronů spolupracující s NADPH:cytochrom P450 reduktasou a NADH:cytochrom b5reduktasou 3, který je spjatý s metabolismem zprostředkovaným cytochromy P450. Cytochrom b5 je schopen prostřednictvím modulace aktivity cytochromů P450 ovlivňovat metabolismus řady látek. Cílem disertační práce bylo využít místně cílenou mutagenezi cytochromů P450 rodiny 1 k lepšímu porozumění mechanismu jejich nitroreduktasové aktivity. Dále byla studována interakce cytochromu b5 s cytochromy P450 podrodiny 1A pomocí místně cílené mutageneze jejich předpokládaného kontaktního rozhraní. V rámci práce byly také, za použití kombinace experimentu a teoretických přístupů, studovány rozdíly v redukci lidských cytochromů P450 v intaktních bakteriálních buňkách během jejich heterologní exprese. Z výsledků vyplývá, že nitroreduktasová aktivita CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 je zprostředkována hydroxylovou skupinou v aktivním místě a jejím zavedením lze u CYP1B1 artificiálně vyvolat nitroreduktasovou aktivitu. Pomocí mutageneze byly také identifikovány aminokyseliny, které se...
|
|
|
Site-directed mutagenesis of human cytochromes P450 family 1 and their interacting partners
Milichovský, Jan ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Befekadu, Asfaw (oponent) ; Souček, Pavel (oponent)
Cytochromy P450 jsou rozsáhlou skupinou proteinů metabolizujících široké množství substrátů. Řada z nich se významně podílí na metabolismu léčiv či jiných xenobiotik včetně řady chemických karcinogenů. Hemoprotein cytochrom b5 je jedno-elektronový přenašeč elektronů spolupracující s NADPH:cytochrom P450 reduktasou a NADH:cytochrom b5 reduktasou 3, který je spjatý s metabolismem zprostředkovaným cytochromy P450. Cytochrom b5 je schopen prostřednictvím modulace aktivity cytochromů P450 ovlivňovat metabolismus řady látek. Cílem disertační práce bylo využít místně cílenou mutagenezi cytochromů P450 rodiny 1 k lepšímu porozumění mechanismu jejich nitroreduktasové aktivity. Dále byla studována interakce cytochromu b5 s cytochromy P450 podrodiny 1A pomocí místně cílené mutageneze jejich předpokládaného kontaktního rozhraní. V rámci práce byly také, za použití kombinace experimentu a teoretických přístupů, studovány rozdíly v redukci lidských cytochromů P450 v intaktních bakteriálních buňkách během jejich heterologní exprese. Z výsledků vyplývá, že nitroreduktasová aktivita CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 je zprostředkována hydroxylovou skupinou v aktivním místě a jejím zavedením lze u CYP1B1 artificiálně vyvolat nitroreduktasovou aktivitu. Pomocí mutageneze byly také identifikovány aminokyseliny, které se...
|
|
|
Příprava lentivirového expresního vektoru s reportérovým genem
Skořepa, Ondřej ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Milichovský, Jan (oponent)
Vedle rekombinantní exprese proteinů v prokaryotických buněčných liniích (E. coli) se dostávají do popředí systémy, které rychle, spolehlivě a stabilně produkují rekombinantní proteiny v lidských buněčných liniích. Ty zaručují vhodnou terciární strukturu a posttranslační modifikace požadovaných produktů. Jednou z možností, jak docílit produkce rekombinantních proteinů v lidských buněčných liniích, je použití lentivirových vektorů. Tato práce popisuje přípravu lentivirového vektoru (plazmidu) Daedalus, který obsahuje konstrukt pro rekombinantní expresi sekretované alkalické fosfatázy. K přípravě požadovaného plazmidu byly použity metody založené na inzerci genu sekretované alkalické fosfatázy pomocí restrikčních endonukleáz a metody, založené na amplifikaci polymerázovou řetězovou reakcí, klonování bez restrikčního štěpení, přenosová polymerázová reakce a Gibsnova reakce.
|
|
|
Příprava expresních vektorů pro receptor NKp30 a jeho ligandy B7-H6 a BAG-6
Pažický, Samuel ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Milichovský, Jan (oponent)
NK buňky, buňky neadaptivního imunitního systému, jsou schopny za pomoci celé řady inhibičních a aktivačních receptorů rozeznat především virem infikované a nádorové buňky a následně je eliminovat. Pro NKp30, aktivační receptor NK buněk ze skupiny receptorů NCR (Natural Killer Cell Receptors), byla v poslední době identifikována několik ligandů, mezi které patří také membránový protein B7-H6 exprimovaný na nádorových buňkách a BAG-6, jaderný protein se širokým spektrem funkcí. Cílem mé bakalářské práce bylo připravit expresní vektory kódující receptor NKp30 a jeho ligandy B7-H6 a BAG-6, které by umožňovaly produkovat tyto proteiny v expresním systému HEK293. Klíčová slova: NK buňka, plasmid, receptor, NKp30, B7-H6, BAG-6
|
host ::
RSS.