|
|
Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Při metabolismu xenobiotik a endogenních látek se uplatňuje monooxygenasový systém, jehož součástí je i cytochrom b5 participující na katalytické činnosti cytochromů P450 (CYP). Mechanismus působení cytochromu b5 v tomto souboru enzymů však nebyl doposud zcela objasněn. Předpokládá se, že se buď přímo podílí na přenosu elektronů v rámci monooxygenasového systému, nebo může alostericky působit na konformaci CYP. Proto je důležité získat co nejčistší apoformu cytochromu b5, která není schopna přenosu elektronů, a dále studovat vliv této nehemové formy cytochromu b5 na činnost CYP. Získané výsledky pak mohou přispět k poznání mechanismu působení cytochromu b5. V průběhu této práce byla provedena transformace bakteriálního kmene buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold expresním vektorem pET22b, který nesl geny pro mikrosomální a erytrocytární formu cytochromu b5. Za účelem produkce vysokého podílu apoproteinové formy byla heterologní exprese cytochromu b5 indukována vyšším přídavkem IPTG a byla provedena při 37řC. Tato bakalářská práce se pak zabývá zejména purifikací jak mikrosomální, tak i erytrocytární formy cytochromu b5 a to hlavně jeho apoformy. Jelikož však při expresi dochází vždy ve větší či menší míře i k produkci hemové formy cytochromu b5, byla i ta izolována. Holo- a apoproteinová forma...
|
|
|
Studium fotodynamické inaktivace prionů ftalocyaniny.
Kostelanská, Marie ; Holada, Karel (vedoucí práce) ; Zimčík, Petr (oponent) ; Kolářová, Hana (oponent)
Transmisivní spongiformní encefalopatie neboli prionové choroby jsou smrtelná neurodegenerativní onemocnění postihující savce. U postižených jedinců se v CNS hromadí ložiska patologického prionového proteinu (PrPTSE ), která jsou příčinou smrti. Priony vykazují afinitu k různým povrchům a odolnost ke konvenčním sterilizačním procedurám. To zvyšuje riziko nosokomiálního přenosu prostřednictvím chirurgických nástrojů použitých při lékařských zákrocích na jedincích v subklinickém stádiu prionového onemocnění. V disertační práci posuzujeme použitelnost metody fotodynamické inaktivace (PDI) pro dekontaminace prionů. PDI byla iniciována deriváty ftalocyaninu (Pc): AlPcOH(SO3)2, SiPc(OH)2(SO3)1-3 nebo ZnPc(SO3)1-3 pro dekontaminace prionů. Světlem aktivované Pc generují reaktivní formy kyslíku, zejména singletní kyslík (O2(1 ∆g)), který jsme detekovali pomocí jodidové metody, inhibičního testu s NaN3 a oxidační degradací kyseliny močové. PDI v suspenzi infekčního mozkového homogenátu vedla k eliminaci signálu PrPres (fragment PrPTSE rezistentní proteináze K) pod detekční limit western blotu při nanomolární koncentraci AlPcOH(SO3)2. Úplná eliminace signálu PrPres byla doprovázena 20% redukcí koncentrace proteinů mozkového homogenátu, nedocházelo k fragmentaci ani agregaci proteinů. PDI indukovaná deriváty...
|
|
|
Heterologní exprese a purifikace lidské NADPH: cytochrom P450 oxidoreduktasy
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
NADPH: cytochrom P450 oxidoreduktasa (POR) je nezbytnou složkou řady metabolických procesů, kde vystupuje jako přenašeč redukčních ekvivalentů mezi NADPH a redoxním partnerem. K takovým procesům patří i katalytické reakce cytochromů P450, které se markantně podílejí na metabolismu steroidních hormonů, léčiv a xenobiotik. Obzvláště pak mikrosomální cytochromy P450 jsou striktně závislé na elektronové podpoře ze strany POR a společně vytvářejí systém oxygenas se smíšenou funkcí. Mutace v proteinové struktuře POR mohou doléhat na aktivitu jeho redoxních partnerů a některé polymorfismy POR mohou vést až k vážným poruchám, většinou spojených s defektním metabolismem steroidů. V této práci byla připravena POR nesoucí dvojí mutaci A503V a P228L. Doposud však nebylo prokázáno, že by byl tento polymorfismus asociován s jakýmkoli neobvyklým vývojovým fenotypem či poruchou, které by měly devastující účinky na lidský organismus. Nicméně při některých metabolických studiích se hodnoty aktivity A503V odlišují od hodnot stanovených pro wild-type formu POR. V rámci této diplomové práce byly připraveny konstrukty rekombinantní plasmidové DNA nesoucí gen pro lidskou POR nebo gen pro lidskou POR s histidinovou kotvou. Oba konstrukty byly založeny na expresním vektoru pCW. Rekombinantní POR bez histidinové kotvy byla...
|
|
|
Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Při metabolismu xenobiotik a endogenních látek se uplatňuje monooxygenasový systém, jehož součástí je i cytochrom b5 participující na katalytické činnosti cytochromů P450 (CYP). Mechanismus působení cytochromu b5 v tomto souboru enzymů však nebyl doposud zcela objasněn. Předpokládá se, že se buď přímo podílí na přenosu elektronů v rámci monooxygenasového systému, nebo může alostericky působit na konformaci CYP. Proto je důležité získat co nejčistší apoformu cytochromu b5, která není schopna přenosu elektronů, a dále studovat vliv této nehemové formy cytochromu b5 na činnost CYP. Získané výsledky pak mohou přispět k poznání mechanismu působení cytochromu b5. V průběhu této práce byla provedena transformace bakteriálního kmene buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold expresním vektorem pET22b, který nesl geny pro mikrosomální a erytrocytární formu cytochromu b5. Za účelem produkce vysokého podílu apoproteinové formy byla heterologní exprese cytochromu b5 indukována vyšším přídavkem IPTG a byla provedena při 37řC. Tato bakalářská práce se pak zabývá zejména purifikací jak mikrosomální, tak i erytrocytární formy cytochromu b5 a to hlavně jeho apoformy. Jelikož však při expresi dochází vždy ve větší či menší míře i k produkci hemové formy cytochromu b5, byla i ta izolována. Holo- a apoproteinová forma...
|
host ::
RSS.