|
|
Příprava a purifikace plasmidových DNA
Němeček, Milan ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
S rozvojem terapeutických metod v lékařství, jako jsou DNA vakcíny a genová terapie, se zvyšuje poptávka po nových postupech izolace a purifikace vysoce čisté plazmidové DNA. Nejčastěji využívanými metodami purifikace plazmidové DNA jsou metody chromatografické. V experimentální části byla provedena izolace plazmidové DNA pUC 19 metodou alkalické lýze. A následně byla provedena purifikace plazmidové DNA agarózovou gelovou elektroforézou a kapalinovou chromatografií.
|
|
|
Výskyt rezistence ke kolistinu u izolátů klinicky významných enterobakterií
Smělíková, Eva ; Tkadlec, Jan (vedoucí práce) ; Ježek, Petr (oponent)
Kolistin je rezervním antibiotikem pro léčbu závažných infekcí způsobených bakteriemi z čeledi Enterobacteriaceae a jinými gramnegativními bakteriemi vykazujícími mnohočetnou rezistenci k antibiotikům. Nedávno objevená plazmidově vázaná rezistence ke kolistinu mediovaná geny mcr však představuje vážné riziko omezení jeho použití. V předkládané diplomové práci byl kombinací selektivní kultivace a qPCR mapován výskyt Enterobacteriaceae nesoucích geny mcr-1-8 u hospitalizovaných pacientů, cestovatelů, klinických izolátů rezistentních ke kolistinu a v retrospektivní sbírce klinických izolátů enterobakterií. Izoláty nesoucí geny mcr byly charakterizovány celogenomovým sekvenováním. Byla určena lokalizace genů mcr, identifikovány další geny rezistence a přítomné plazmidy. Byl charakterizován fyziologický profil vybraných izolátů Escherichia coli a bylo zjištěno, že za přítomnosti subinhibičního množství kolistinu může být favorizován kmen nesoucí gen mcr-1. V průběhu řešení diplomové práce byl popsán také gen mcr-9, jehož výskyt byl následně retrospektivně otestován. Izoláty Enterobacter spp. s detekovaným genem mcr-9 byly většinou ke kolistinu citlivé, avšak v několika případech bylo možné rezistenci indukovat expozicí subinhibičním dávkám kolistinu. Výsledky diplomové práce ukazují, že výskyt plazmidově vázané...
|
|
|
Znalosti a názory žáků na geneticky modifikované organismy
Semencová, Barbora ; Hlaváčová, Lucie (vedoucí práce) ; Vojíř, Karel (oponent)
Tato práce se věnuje tématu geneticky modifikovaných organismů a jejich využití v praktických odvětvích lidského života. Teoretická část práce vymezuje obecné pojmy GMO, plazmid, genové inženýrství, biotechnologie. Dále zaznamenává historické milníky v souvislosti s problematikou, věnuje se jednotlivým technikám genového inženýrství a stručně uvádí legislativní postupy v souvislosti s nakládáním s GMO. Uvádí příklady transgenních organismů a výhody a nevýhody jejich využívání. Tvůrčí část práce obsahuje řešitelem koncipovaný výukový program Geneticky modifikované organismy, který obsahuje návrh vyučovací hodiny včetně výukových materiálů - powerpointové prezentace, pracovních listů, interaktivních pracovních listů, pomocného textu pro učitele a písemné přípravy. Výzkumná část se zabývá změnou názoru na využívání GMO padesáti dvou žáků středních škol po absolvování řešitelova výukového programu. Analýzou bylo prokázáno, že většina postojů a znalostí žáků vzhledem ke GMO byla po realizaci vzdělávacího programu změněna (například v otázkách ochoty konzumovat GM potraviny a živočišné produkty, vnímání výhod a nevýhod atd.), nezměněny zůstaly v podstatě pouze otázky neovlivnitelné programem (například kontrola obalů potravin, zdali se žáci setkali s GM potravinami atd.).
|
|
| |
|
|
Příprava lentivirového expresního vektoru s reportérovým genem
Skořepa, Ondřej ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Milichovský, Jan (oponent)
Vedle rekombinantní exprese proteinů v prokaryotických buněčných liniích (E. coli) se dostávají do popředí systémy, které rychle, spolehlivě a stabilně produkují rekombinantní proteiny v lidských buněčných liniích. Ty zaručují vhodnou terciární strukturu a posttranslační modifikace požadovaných produktů. Jednou z možností, jak docílit produkce rekombinantních proteinů v lidských buněčných liniích, je použití lentivirových vektorů. Tato práce popisuje přípravu lentivirového vektoru (plazmidu) Daedalus, který obsahuje konstrukt pro rekombinantní expresi sekretované alkalické fosfatázy. K přípravě požadovaného plazmidu byly použity metody založené na inzerci genu sekretované alkalické fosfatázy pomocí restrikčních endonukleáz a metody, založené na amplifikaci polymerázovou řetězovou reakcí, klonování bez restrikčního štěpení, přenosová polymerázová reakce a Gibsnova reakce.
|
|
|
Příprava expresních vektorů pro NKp65 a KACL, nových zástupců rodiny lidských NK buněčných receptorů
Mikulová, Barbora ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
NK buňky (natural killer cells, "přirození zabíječi") jsou významnou složkou vrozeného imunitního systému a mají schopnost rozpoznat a zabít především nádorové a virem infikované buňky. Na svém povrchu mají celou řadu inhibičních a aktivačních receptorů, pomocí kterých rozhodují o osudu cílových buněk. Imunitní odpověď je nejčastěji spuštěna po navázání NK buněčného receptoru na svůj ligand. Takovými receptor-ligandovými systémy jsou např. NKp80-AICL a NKRP1-LLT1 na lidských lymfocytech. Další receptor-ligandový pár představují NKp65 a KACL, dva nedávno objevené lektinové receptory lidských imunocytů. NKp65, blízký příbuzný NKp80, je glykoprotein, který funguje jako aktivační imunoreceptor na NK92MI buňkách. KACL je posledním objeveným členem lidské rodiny receptorů CLEC2 a je lokalizován téměř výhradně v kůži. Pomocí povrchové plazmonové rezonance bylo zjištěno, že NKp65 je vysokoafinitní receptor pro KACL. Cílem mé bakalářské práce bylo připravit expresní vektory kódující lidské NK buněčné receptory NKp65 a KACL, produkovat tyto proteiny v expresním systému HEK293T buněk a provést jejich purifikaci. Klíčová slova: NKp65, KACL, NK buňka, lektin, receptor, plazmid
|
|
|
Molekulárně genetická charakterizace vankomycin-rezistentních enterokoků
Bubeníček, Karel ; Rada, Vojtěch (vedoucí práce) ; Igor, Igor (oponent)
Souhrn
Cíle a hypotéza: Tato diplomová práce se zabývá studií plazmidů vankomycin-rezistentních enterokoků izolovaných z trusu amerických vran v letech 2012 až 2013.
Hypotézou je, že v různých prostředích existuje jeden či více typů epidemiologicky významných vanA gen-nesoucích plazmidů, které jsou schopné se horizontálně šířit.
Metody: Na základě metody PFGE byl detekován počet a velikost plazmidů ve vybraných izolátech vankomycin rezistentních E. faecium. Pomocí metody PCR byly izoláty podrobeny detekci genů replikáz, relaxáz a toxin antitoxin systému pro typizaci plazmidů z jednotlivých plazmidových rodin. Pomocí 19 primerů byly charakterizovány typy Tn1546.
Výsledky: Z celkového počtu 12 testovaných, vankomycin rezistentních izolátů E. faecium, byl pomocí metody PFGE prokázán počet a velikost plazmidů: 2 izoláty obsahovaly 2 plazmidy (17 %), 3 izoláty obsahovaly 3 plazmidy (25 %), 5 izolátů obsahovalo 4 plazmidy (42 %) a 2 izoláty obsahovalo 5 plazmidů (17 %).
Všechny izoláty (n=12) byly pak podrobenydetekci genů replikáz, relaxáz a toxin-antitoxin systému pro typizaci plazmidů z jednotlivých plazmidových rodin.
RepA_N rodina plazmidů:
geny charakterizující plazmidy příbuzné pRUM: rep17 u 11 izolátů (92%), u 5 izolátů (42%) byl detekován gen AxeTxe
geny charakterizující plazmidy příbuzné pLG1: rep20 u 7 izolátů (58%)
geny charakterizujcící plazmidy příbuzné pAD1: u 1 izolátu (8%) byl detekován gen relpAD1
Inc18 rodina plazmidů:
geny charakterizující plazmidy příbuzné pIL501: gen rep1 zachycen v jednom případě (8%)
geny charakterizující plazmidy příbuzné pRES25: Gen rep2 u dvou izolátů (17%)
geny chrarakterizující plazmidy příbuzné pEF1: relpEF1 detekován u 11 izolátů (92%)
pHTB rodina plazmidů:
geny charakterizující plazmidy příbuzné pHTB: u 4 izolátů byl detekován gen Rep22 (33%) a u 2 izolátů (17 %) byl detekován gen relpHTB
RCR rodina plazmidů:
geny charakterizujcí plazmidy příbuzné pRI: u 8 izolátů (67%) byl pozitivní průkaz genu Rep14 a u 4 izolátů byl detekován gen relpRI..
Malé theta replikující se plazmidy:
geny charakterizující plazmidy příbuzné pEF418: gen rep18a u dvou izolátů (17 %)
geny charakterizující plazmidy příbuzné pB82: u 1 izolátu (8%) byl detekován gen rep18b
geny charakterizující plazmidy příbuzné pCIZ2: u 9 testovaných izolátů (75%) byl prokázán gen relpCIZ2
Typy transpozonu Tn1546
Pomocí metody PCR byly charakterizovány typy Tn1546. U 4 izolátů (n=12; 33 %) byl chareakterizován Tn1546 jako typ F3. U jednoho izolátu (8 %) byl Tn1546 charakterizován jako typ F5, u jednoho izolátu (8 %) jako typ PP-16. 6 izolátů mělo netypovatelné Tn1546. S největší pravděpodpbností se jedná o nové, dosud nepopsané typy.
Závěr: Jedná se o první studii plazmidů z vankomycin rezistentních izolátů E. faecium izolovaných z trusu amerických vran. Tyto výsledky zdůrazňují nejen vysoké zastoupení plazmidů v jednotlivých izolátech, ale také vysoké zastoupení genů s horizontálním přenosem.
|
|
|
Příprava a purifikace plasmidových DNA
Němeček, Milan ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
S rozvojem terapeutických metod v lékařství, jako jsou DNA vakcíny a genová terapie, se zvyšuje poptávka po nových postupech izolace a purifikace vysoce čisté plazmidové DNA. Nejčastěji využívanými metodami purifikace plazmidové DNA jsou metody chromatografické. V experimentální části byla provedena izolace plazmidové DNA pUC 19 metodou alkalické lýze. A následně byla provedena purifikace plazmidové DNA agarózovou gelovou elektroforézou a kapalinovou chromatografií.
|
|
|
Plasmidové DNA vakcíny
Machan, Radoslav ; Chroboková, Maria (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Plazmidové DNA vakcíny predstavujú novú generáciu vakcín s veľkým potenciálom pri prevencii mnohých ochorení. Súčasné štúdie a klinické testy sa zameriavajú na prevenciu pred rakovinou, hepatitídou, maláriou, HIV, chrípky a inými chorobami. Hlavné výzvy týkajúce sa plazmidových DNA vakcín sú v súčasnosti spojené s optimalizáciou jednotlivých krokov výroby a najmä v purifikačných krokoch umožňujúcich výrobu pDNA v množstvách až niekoľkých kilogramov. Hlavnými purifikačnými technikami sú v súčastnosti chromatografické metódy, ale výzkum a vývoj poukazuje aj na potenciálne využitie iných metód, napríklad dvojfázových vodných systémov a magnetických nosičov. V experimentálnej časti bola prevedená izolácia plazmidu pUC 19 z kultúry buniek Escherichia coli JM 109 (pUC 19) metódou alkalickej lýzy. Izolácia bola overená agarózovou gélovou elektroforézou. Izolované vzorky boli purifikované chloridom lítnym a magnetickými nosičmi a miera purifikácie overená spektrofotometricky. Jednotlivé vzorky boli znovu vizualizované agarózovou gélovou elektroforézou a výsledky porovnané.
|
host ::
RSS.