|
|
Capturing chromatin-associated proteins in nucleosomal context
Koutná, Eliška ; Veverka, Václav (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
| 11 ABSTRAKT Eukaryotická DNA je v buněčném jádře ovinutá okolo histonových oktamerů, a tímto způsobem uložena ve formě nukleosomů. Tyto základní jednotky chromatinu poskytují vazebné rozhraní skrze DNA a N-koncové části histonů, které podléhají kovalentním posttranslačním modifikacím, jež v kombinaci s modifikacemi DNA definují epigenetický kód. Eukaryotická transkripce závisí na těchto specifických histonových modifikacích - jejich rozpoznávání chromatinovými reader proteiny spouští složité procesy, které spoléhají na koordinovanou asociaci transkripčních regulačních faktorů. Ačkoli různé typy modifikací konkrétního histonového residua často vedou k rozdílným funkčním důsledkům, není zcela jasné, jak jsou rozlišovány na molekulární úrovni. Kromě toho, význam vnitřně neuspořádaných oblastí mimo specializované reader domény pro vazbu na nukleosomy je dosud prozkoumán jen málo. Hlavní pozornost v této práci je věnována transkripčnímu koaktivátoru LEDGF/p75, který je schopen číst histonovou značku H3K36me2/3, a iniciačnímu transkripčnímu faktoru Sox2. Pomocí strukturně biologických a biofyzikálních technik je zkoumána interakce LEDGF a Sox2 s nukleosomy, přičemž jsou popsána specifika jejich vnitřně neuspořádaných motivů interagujících s DNA. Dvě cryo- EM struktury LEDGF vázaného na nukleosom...
|
|
|
Strategie a výsledky při vývoji derivátů insulinu pro léčbu diabetu
Pokorný, Štěpán ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Cílem této bakalářské práce je přiblížit analogy insulinu a analyzovat jakým směrem se vývoj těchto organických sloučenin vyvíjí. V textu práce jsou uvedeny základní informace týkající se této problematiky (např. historie onemocnění Diabetes Mellitus, první způsoby léčby, objevení insulinu (1921) a experimenty, které tomuto objevu předcházely...). Práce dále předkládá základní rozdíly v onemocnění Diabetes Mellitus 1. a 2. typu, a z toho plynoucí rozdíly v léčbě. Jsou zde především shrnuty konkrétní typy analogů, jejich chemické složení a podstata jejich působení. Hlavní přínos této práce spočívá v analýze analogů insulinu a přibližuje jakým směrem se vývoj analogů ubírá v této době, či jaké inovace můžeme v terapii diabetu očekávat v nadcházejících letech. Práce čerpá především z odborných vědeckých článků, časopisů či knih (starších, ale i novějších) a odborných poznatků z laboratoře ÚOCHB. Všechny zdroje jsou řádně uvedeny na konci práce.
|
|
|
Whole genome synthesis: methodology and applications
Kučera, Vítězslav ; Hlouchová, Klára (vedoucí práce) ; Nedvědová, Jana (oponent)
Genom je nositelem informace potřebné pro tvorbu života a virů. Rozklíčování této informace je nelehký úkol, nicméně úkol nezbytný pro pochopení života a jeho evoluce. Sekvenování genomů může poskytnout užitečný vhled do smyslu této informace. Hlubší pochopení komplexity života ovšem vyžaduje vytvoření syntetické genomové DNA, která rozšíří naše znalosti a poskytne startovní plochu pro další využití. Ohromující pokrok v metodice syntézy DNA v posledních desetiletích umožnil sestavení prvního umělého buněčného genomu v roce 2008. Vytrvalý rozvoj genomové syntézy a inženýrství je hnací silou syntetické biologie. Historie, současný stav a budoucí využití totální genomové syntézy jsou představeny v této práci. Kíčová slova: skládání DNA, syntetická biologie, minimální buňka, genomová úprava, genomová transplantace, syntéza DNA, top-down metoda, bottom-up metoda
|
|
|
Inhibitors of rhomboid proteases as tools for cell biology
Kuzmík, Ján ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Rhomboidní proteázy jsou intramembránové serinové proteázy. Původně byly objeveny jako proteiny důležité pro zárodečný vývoj Drosophily melanogaster, dnes je však známo, že se nachází napříč všemi skupinami organismů a jsou spojovány s řadou významných onemocnění a patogenů. Příkladem je malárie, úplavice, Parkinsonovo onemocnění, řada typů rakoviny či diabetes. Avšak u řady rhomboidních proteáz dosud neznáme jejich přirozené substráty, a tedy ani jejich funkce není často objasněna na molekulární úrovni. Vývoj jejich specifických inhibitorů je důležitý jednak pro jejich využití jako nástrojů buněčné biologie k objasnění role rhomboidních proteáz, ale také pro jejich potenciální využití ve farmakoterapii. Doposud známé inhibitory rhomboidních proteáz jsou charakteristické elektrofilním centrem, které cílí na nukleofilní serin v rámci neobvyklé serin-histidinové katalytické dyády rhomboidů. Zatím největší potenciál vykazují inhibitory v podobě peptidyl -ketoamidů s různými substituenty vázanými na dusík ketoamidové skupiny, které byly dříve vyvinuty v naší laboratoři. Jsou velmi účinné, reverzibilní, selektivní a laditelné. Jejich výhodou je také to, že využívají elektrofilní ketoamidovou skupinu, která je součástí i některých již schválených léčiv. Cílem mé práce bylo pokusit se dále zvýšit účinnost těchto...
|
|
|
Biochemical tools for targeting immunomodulatory receptor CD73
Poukarová, Magdalena ; Ormsby, Tereza (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Rakovina je jednou z nejčastějších příčin úmrtí. Proto se hledají stále nové způsoby pro efektivní léčbu. Jedním z velmi perspektivních odvětví onkologie je imunoterapie, která je založena na aktivaci imunity v boji s maligními buňkami. Některá léčiva již byla schválena, ale pouze u části pacientů se dostavují očekávané výsledky. O ekto-5'-nukleotidase CD73 se v posledních letech uvažuje jako o novém potenciálním cíli imunoterapie. Exprese tohoto enzymu, zakotveném na extracelulární membráně pomocí GPI, je významně zvýšena v nádorových buňkách a v imunitních buňkách nádorového mikroprostředí. CD73 katalyzuje hydrolýzu AMP na imunosupresivní adenosin, čímž přispívá k imunosupresivnímu prostředí v nádoru a podílí se na rezistenci vůči imunoterapii. CD73 se zdá být slibným cílem pro kombinovanou léčbu, která by vedla ke zlepšení účinku jiných imunoterapeutických léků. Momentálně probíhá několik klinických studií protilátek CD73 a malých molekul inhibujících CD73. Tato diplomová práce popisuje vývoj nových biochemických nástrojů pro cílení CD73. Citlivá metoda DNA-linked Inhibitor ANTibody Assay (DIANA), umožňující měření vazebné afinity nízkomolekulárního inhibitoru k proteinu, byla optimalizována a použita při screeningu knihovny malých molekul. Identifikovali jsme dvě kandidátní molekuly, které byly...
|
|
|
Functional screening of de novo proteins
Melikov, Aleksandr ; Hlouchová, Klára (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent)
Syntetická biologie obnáší práci zejména se dvěma hlavními typy biologických makromolekul - nukleovými kyselinami a proteiny. Přírodní proteiny představují zanedbatelnou část celého sekvenčního prostoru. Většina tohoto prostoru je dosud neprozkoumaná (jak biologickými systémy, tak i vědeckým úsilím) a může skýtat nepoznaný strukturní a funkční potenciál, kterým se syntetická biologie a proteinové inženýrství zabývá zhruba jen poslední dvě desetiletí. Charakterizace nepřirozených proteinů zahrnuje několik klíčových aspektů: strukturu a její stabilitu, funkci, možnosti interakce s jinými proteiny, nukleovými kyselinami či kofaktory a v neposlední řadě in vivo tolerance. Tato práce se zaměřuje prioritně na funkční testování de novo proteinů, vzešlých buď z dříve nekódujících genomových oblastí, nebo jako produkty proteinového inženýrství. Klíčová slova: de novo proteiny, funkční screening, proteinové knihovny, design proteinů, sekvenční prostor
|
|
|
Komplementační peptid LacZ-alfa jako nástroj pro studium molekulární evoluce
Ptáčková, Barbora ; Hlouchová, Klára (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Proteiny jsou stavební a funkční podstatou všech živých organismů. Ačkoliv o jejich strukturních a funkčních vlastnostech dnes víme poměrně mnoho, jejich evoluce je pro nás stále nejasná. V současné době převažuje názor, že prvotní genetický kód obsahoval menší počet aminokyselin a postupem evoluce k němu byly přiřazovány aminokyseliny evolučně novější. Obecně uznávané teorie a studie předpokládají dva zdroje raných aminokyselin (exogenní a endogenní). Z rozsáhlého repertoáru prebioticky dostupných aminokyselin je v současnosti jen 10 geneticky kódovaných, tedy proteinogenních. Zbylých 10 proteinogenních (tedy evolučně novějších) aminokyselin zřejmě vzniklo až v důsledku evoluce biosyntetických drah. Otázkou zůstává, je-li raná polovina současných proteinogenních aminokyselin dostačující pro tvorbu strukturovaných a funkčních proteinů, které mohly dát vznik prvotnímu metabolismu. A je v současném světě možné nahradit evolučně novější aminokyseliny těmi ranými za současného udržení strukturně-funkční integrity? Právě tyto otázky tvoří základ předkládané práce. Cílem této práce bylo připravit metodiku pro mutagenezi zkráceného LacZ-alfa peptidu za účelem pozdějšího studia randomizace evolučně novějších aminokyselin za rané. Jako modelový protein byl vybrán LacZ-alfa peptid, který je v molekulární...
|
|
|
Příprava mutantů enzymu methioninsulfoxidreduktasy a jejich využití pro přípravu chirálních sulfoxidů
Havelka, Václav ; Míšek, Jiří (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Chirální sulfoxidy jsou důležité sloučeniny ve farmaceutickém a chemickém průmyslu, nicméně jejich enantioselektivní syntéza poskytující pouze jeden žádaný enantiomer není zcela zvládnuta. Některé přirozené enzymy mohou být využity pro biokatalytickou přípravu chirálních sulfoxidů. Jedním z takových enzymů je methioninsulfoxidreduktasa. Methioninsulfoxidreduktasa je enzym omezující následky reaktivních kyslíkových radikálů v organizmu vznikajících v důsledku kyslíkového metabolismu. Její funkce je redukce methioninsulfoxidu v proteinech na methionin. Existují dva typy methioninsulfoxidreduktas, methioninsulfoxidreduktasa A redukující pouze (S)-methioninsulfoxid a methioninsulfoxidreduktasa B redukující (R)-methioninsulfoxid. Methioninsulfoxidreduktasa B je vhodná k přípravě (S)-sulfoxidů, nicméně její katalytická aktivita není dostatečná pro praktické využití. Využitím technik rekombinantní DNA a mutagenní PCR byla připravena knihovna mutantů methioninsulfoxidreduktasy B a byla určena míra a charakter zavedených mutací. Tato knihovna bude sloužit jako výchozí bod pro řízenou evoluci enzymu pro získání klonů se zvýšenou aktivitou a sníženou substrátovou specifitou.
|
|
|
Exprese vaskulárního endotelového růstového faktoru a jeho využití v cévním tkáňovém inženýrství
Mikulová, Barbora ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Tato práce se zabývá expresí vaskulárního endotelového růstového faktoru (vascular endothelial growth factor, VEGF) a jeho využitím v tkáňovém inženýrství cévní stěny. V průběhu práce byla sledována interakce endotelových buněk s modifikovaným biomateriálem na bázi fibrinu, do kterého byl inkorporován růstový faktor cévního endotelu (VEGF-A121). Tato modifikace podpořila adhezi a růst endotelových buněk. Vaskulární endotelový růstový faktor VEGF-A121 je signální glykoprotein, který aktivuje transmembránové receptory na endotelových buňkách. VEGF-A121 je klíčovým regulátorem při vaskulogenezi, angiogenezi, proliferaci, migraci a přežití endotelových buněk. V rámci této práce byl tento protein heterologně exprimován s fúzním partnerem thioredoxinem v expresním systému E. coli Origami B (DE3). Rekombinantní VEGF-A121 byl navíc koexprimován s bakteriálními chaperony GroEL/GroES pro možné zvýšení jeho rozpustnosti a biologické aktivity. V další části této práce byla na povrchu polystyrenu katalytickým působením trombinu navázaným na adsorbovanou monovrstvu fibrinogenu připravena tenká fibrinová síť. Takováto síť byla dále obohacena o růstový faktor cévního endotelu (VEGF-A121), který do ní byl kovalentně inkorporován pomocí enzymové aktivity transglutaminasy (faktoru XIIIa). Poslední část je věnována...
|
|
|
Regulace metabolismu purinových nukleotidů jako farmakologický cíl
Brinsa, Vítězslav ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Purinové nukleotidy tvoří základní stavební kameny DNA a RNA. Jsou nepostradatelnou součástí struktury některých kofaktorů, podílejí se na přenosu a skladování energie, buněčné signalizaci a regulaci biochemických procesů v buňce. Pro správnou funkci, přežití a dělení buněk je naprosto nezbytné, aby měly neustále dostatečnou zásobu nukleotidů. Hladina purinových nukleotidů je v lidském těle regulována prostřednictvím jejich metabolismu, jenž sestává ze tří koordinovaných procesů. Těmi jsou de novo syntéza, resyntéza a degradace. Regulace těchto procesů je řízena na různých buněčných úrovních od regulace genové exprese zapojených enzymů, jejich allosterické regulace až po utváření multienzymových komplexů v de novo syntéze - tzv. purinosomů. Důležitou složkou metabolismu purinových nukleotidů jsou fosforibosylpyrofosfát synthetasa I (PRS-I) a cytosolická purinová 5'-nukleotidasa (cN-II). Tyto enzymy se významně podílejí na regulaci hladiny purinů prostřednictvím jejich allostericky regulované aktivity. Poruchy aktivity těchto enzymů jsou spojeny různými onemocněními včetně dny, tvorby ledvinových kamenů, neurologických dysfunkcí či akutní lymfoblastické leukemie (ALL). Mutantní varianta cN-II nesoucí mutaci R238W způsobuje relaps ALL. Cílem experimentální části této práce byla příprava a...
|
host ::
RSS.