|
|
Proteomic analysis of myocardial integral membrane proteins
Oliva, Tomáš ; Petrák, Jiří (vedoucí práce) ; Pompach, Petr (oponent)
Kardiovaskulární onemocnění představují nejvyšší zdroj mortality i morbidity v Evropě. Více než 4 miliony lidí ročně na tato onemocnění zemře a více než 11 milionů nových případů kardiovaskulárních onemocnění se objeví každý rok. Tato čísla jen poukazují na to, že je zde potřeba nejen pro lepší diagnostické, prognostické a prediktivní biomarkery, ale také potřeba pro nové a efektivnější léky. Integrální membránové proteiny (IMP) jsou ideálními kandidáty na nové cíle léčiv. Analýza IMP stále představuje jeden z hlavních problémů současné proteomiky. Důvodem je nízká úroveň exprese IMP, jejich snížená rozpustnost ve vodě a také nedostatek trypsinových štěpných míst v transmembránových segmentech. Byla vyvinuta celá řada metod, které se snaží tyto problémy obejít. Jedná se zejména o metody, které selektivně cílí na N-glykosylované segmenty IMP (CSC, SPEG, N-glyco-FASP), a nebo metody, které naopak cílí na hydrofobní transmembránové segmenty (hpTC). My jsme se v této práci rozhodli spojit dva přístupy, které cílí na N-glykosylované extramembránové segmenty IMP (SPEG a N-glyco-FASP) provedené na dvou typech vzorku (na celotkáňovém lyzátu a membránové frakci) spolu s hpTC metodou, která naopak cílí na hydrofobní transmembránové segmenty a s necíleným "detergent+trypsin" přístupem. Tento kombinovaný...
|
|
|
Příprava a využití kyselých proteáz pro štěpení proteinů v experimentech H/D výměny.
Kukla, Jan ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Pompach, Petr (oponent)
- 4 - Abstrakt Vodík/deuteriová výměna ve spojení s hmotnostní spektrometrií (HX-MS) využívá spontánní výměny amidických vodíků proteinové páteře za atomy deuteria z roztoku k získání informace o změnách v proteinové struktuře. Pro lokalizaci těchto změn na konkrétní oblasti proteinu je nejčastěji využívána enzymatická digesce zkoumaných proteinů aspartátovými proteasami. Schopnost proteas produkovat malé překrývající se peptidy, které dostatečně pokrývají celou proteinovou sekvenci, je zásadní pro lokalizaci konkrétních oblastí, které nás v proteinu zajímají. V této práci byly připraveny rekombinantní proteasy nepenthesin I (z Nepenthes gracilis) a rhizopuspepsin (z Rrizopus chinensis) a byly srovnány s komerčně dostupnými proteasami prasečím pepsinem A a aspergillopepsinem (z Aspergillus saitoi). Porovnání bylo provedeno aktivitními testy, kdy byl zkoumán vliv pH, teploty a denaturačních a redukčních činidel na stabilitu a ktivitu proteas v roztoku. Všechny čtyři proteasy byly imobilizovány na polymerní nosič POROS a jejich aktivita v online HX-MS uspořádání byla testována štěpením myoglobinu jako modelového substrátu.
|
|
|
Imunomodulace kombinovaným působením dvou typů specifických ligandů
Adámek, David ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Pompach, Petr (oponent)
CD69 a NKR-P1 jsou receptory patřící do C-lektinové rodiny leukocytárních receptorů. V současnosti jsme identifikovali dva typy ligandů pro tyto receptory, aktivátory a inhibitory, pomocí nichž lze účinně modulovat odpověď buněk imunitního systému. První třída těchto ligandů (dimerní N-acetyl-D-glukosaminy) je schopna se vázat na oba dva druhy receptorů (CD69 i NKR-P1) a aktivovat tak buňky. Oproti tomu druhá třída ligandů (calix[4]reny) je schopna účinně inhibovat funkce receptoru CD69, nikoli však receptoru NKR-P1. Předmětem této studie bylo najít optimální kombinaci těchto dvou tříd ligandů a prozkoumat výchozí koncentrace těchto látek vhodné pro použití v nádorových terapiích. Účinek ligandů byl sledován v základních testech buněčné aktivace, buněčné smrti (schopnost ochránit buňky imunitního systému před apoptosou) a schopnosti stimulovat buněčné zabíjení.
|
|
| |
|
| |
|
|
Příprava afinitních nosičů pro klinickou diagnostiku
Kalaninová, Zuzana ; Pompach, Petr (vedoucí práce) ; Žáček, Petr (oponent)
Botulotoxiny jsou skupinou proteinových jedů produkovaných bakteriemi rodu Clostridium. Tyto toxiny patří mezi vysoce toxické látky způsobující paralytické onemocnění známé jako botulismus. Na základě své endopeptidasové aktivity toxiny blokují uvolnění neurotransmiteru v spojích nervových buněk. Jelikož se účinky intoxikace dostaví již do 48 hodin a toxin je schopen ve své aktivní formě setrvat až po dobu několika měsíců, byly kategorizovány jako potenciální zbraň bio-terorismu. Z hlediska účinné léčby je tedy důležité nalézt rychlou metodu, která bude schopna nejenom stanovit přítomnost botulotoxinu, ale i jeho konkrétní typ. Tato práce je dokumentací nové metody potenciálně využitelné ke stanovení přítomnosti botulotoxinů v různých matricích. Metoda je založena na detekci produktů proteasové aktivity botulotoxinu A (BoNT/A) pomocí afinitních nosičů a MALDI hmotnostní spektrometrie. V rámci této práce byly k detekci a stanovení limitu detekce produktů aktivity BoNT/A využity afinitní nosiče připravené metodou měkkého přistávání iontů. Pro imobilizaci byly zvoleny proteiny s vysokou afinitou k biotinu - avidin, neutravidin a streptavidin - pro účely nabohacení biotinylovaných peptidových produktů BoNT/A reakce. Metoda využívající kombinaci afinitních nosičů a MALDI hmotnostní spektrometrie se jeví...
|
|
|
Charakterizace glykoforem haptoglobinu v lidském séru
Darebná, Petra ; Pompach, Petr (vedoucí práce) ; Ptáčková, Renata (oponent)
Charakterizace glykoforem haptoglobinu v lidském séru Petra Darebná (Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze, Česká republika) Změny v glykosylaci proteinů jsou spojovány s nádorovými onemocněními, především s hepatocelulárním a kolorektálním karcinomem. Tato práce se zabývá využitím na datech nezávislé analýzy pomocí iontově cyklotronové rezonance s Fourierovou transformací a tandemové hmotností spektrometrie s kapalinovou chromatografií a sledováním více reakcí ke kvantifikaci těchto změn u hepatocelulárního karcinomu, kolorektálního karcinomu a kolorektálního karcinomu s metastázemi do jater. V první fázi projektu byl haptoglobin směsných sér pacientů s hepatocelulárním karcinomem, kolorektálním karcinomem a kolorektálním karcinomem s metastázemi nabohacen pomocí hemoglobinu, imobilizovaného na aktivovanou CNBr Sepharosu 4B a následně purifikován pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie. Jednotlivé glykopeptidy haptoglobinu byly analyzovány pomocí iontově cyklotronové rezonance s Fourierovou transformací. V druhé fázi projektu byla použita pro analýzu změn glykosylace v závislosti na různém nádorovém onemocnění séra jednotlivých pacientů, u nichž byl částečně depletován albumin pomocí etanolového srážení. Jednotlivé fukosylované glykoformy N-glykopeptidů...
|
|
|
Kvantifikace prokalcitoninu v lidském séru pomocí afinitních nosičů a hmotnostní spektrometrie
Dvořák, Josef ; Pompach, Petr (vedoucí práce) ; Kozlík, Petr (oponent)
Sepse je celosvětově rozsáhlé akutní onemocnění vyvolané nepřiměřenou reakcí imunitního systému na přítomnost patogenu v těle pacienta. Rychlá a správná diagnostika sepse umožňuje lékařům nasadit vhodnou léčbu, na kreré závisí pacientův život. Jako její specifický ukazatel se v klinické diagnostice používá protein prokalcitonin (PCT). Koncentrace PCT v krevním oběhu se při sepsi zvýší až tisícinásobně během krátkého časového úseku. Míra závažnosti sepse koreluje se zvyšující se koncentrací PCT. Všechny metody detekce prokalcitoninu v klinických laboratořích vycházejí z měření interakce PCT s protilátkou. Koncentrace prokalcitoninu je následně stanovena metodou kalibrační křivky. U metod využívaných v klinické praxi může dojít k nespecifickým interakcím použité protilátky s biomolekulami přítomnými ve vzorku. Nespecifické interakce mohou zkreslovat laboratorní výsledky. Další nevýhodou je potřeba specializovaných přístrojů pro detekci prokalcitoninu. Díky svým vlastnostem by mohla hmotnostní spektrometrie představovat vhodnou alternativní nebo doplňkovou metodu při kvantifikaci PCT. Cílem této diplomové práce bylo in situ nabohacení PCT na povrchově upravených afinitních nosičích s imobilizovanou protilátkou, které jsou kompatibilní s hmotnostní spektrometrií s laserovou ionizací/desorpcí za...
|
|
|
Příprava afinitních povrchů pro hmotnostní spektrometrii
Kalaninová, Zuzana ; Pompach, Petr (vedoucí práce) ; Kučera, Lukáš (oponent)
Jednou z nejvíce účinných toxických substancí biologického původu známých lidstvu jsou botulotoxiny, nervové jedy produkované bakteriemi rodu Clostridium. Místem jejich účinku jsou nervosvalová zapojení, ve kterých štěpí proteiny SNARE komplexu, čímž zamezí uvolnění neurotransmiteru a přenosu nervového vzruchu. Výsledkem je ochablá paralýza, hlavní symptom onemocnění zvaného botulismus. Kvůli nízké smrtelné dávce a vysoké toxicitě mají BoNTs své místo na seznamu činitelů bioterorismu. I když je dnes k dispozici mnoho metod jejich detekce, "zlatým standardem" jsou dosud biologické testy na myších. Nehledě na etickou stránku těchto experimentů, značnou nevýhodou je i jejich časová náročnost. V této práci je představeno unikátní spojení proteinových povrchů s metodou využívající k detekci aktivních BoNTs jejich endopeptidasovou aktivitu a hmotnostní spektrometrii, EndoPep-MS. Funkcionalizované povrchy byly připraveny metodou měkkého přistávání iontů za atmosférického tlaku, která využívá proud hypertermálních iontů (rozsah energie 1-100 eV), čím umožňuje kontrolovanou modifikaci. Botulotoxin A1 byl detekován dvěma způsoby. První byl založen na interakci avidin-biotin, kdy byly na neutravidinem modifikovaném povrchu nabohaceny biotinem značené peptidy (substrátový peptid pro BoNT/A i peptidové produkty...
|
|
|
Protein chemistry and mass spectrometry in biochemical research
Pompach, Petr
Proteinová chemie a hmotnostní spektrometrie v biochemickém výzkumu Petr Pompach Disertační práce (2006) Katedra Biochemie, Přírodovědecká Fakulta Univerzity Karlovy Abstrakt Hmotnostní spektrometrie se díky svému velmi rychlému rozvoji zařadila mezi oblíbené analytické metody nejen pro detekci malých molekul, ale i pro detekci makromolekul, jakými jsou například proteiny. V této disertační práci jsou shrnuty některé aplikace hmotnostní spektrometrie jednak pro nalezení a popsání jednotlivých proteinů v komplexních směsích, tak i aplikace pro řešení struktury proteinů a jejich postranslačních modifikací. V jednotlivých kapitolách jsou popsány poslední poznatky o analytických přístupech zahrnující separaci proteinů pomocí dvoudimenzionální elektroforézy, vysokoúčinnou separaci proteinů/peptidů na kolonách s obrácenou fází, dále potom sekvenace proteinů Edmanovým odbouráváním, atd. Jako příklad využití hmotnostní spektrometrie pro identifikaci proteinů je v této práci ukázána metoda pro nabohacení a následnou charakterizaci proteinů asociovaných s tzv. membránovými mikrodoménami. Pro řešení struktury proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie se využívá její spojení s metodami proteinové chemie, konktrétně reakcí proteinů s tzv. zesíťovacími činidly. Délka raménka zesíťovacího činidla určuje poté vzdálenost...
|
host ::
RSS.