|
Cell clock
Berger, Josef
Short review on history, clock incidence in unicellular and multicellular organisms, molecular basis of clocks, theory of chaos and regulation of biorhythm.
|
|
Ultrasonografické hodnocení změn kardiovaskulárního systému u nemocných s Fabryho chorobou
Paleček, Tomáš ; Bultas, Jan (vedoucí práce) ; Pudil, Radek (oponent) ; Kittnar, Otomar (oponent)
Fabryho choroba je na X chromozóm vázaná porucha metabolizmu glykosfingolipidů, jejíž podstatou je porucha aktivity lyzozomálního enzymu α-galaktozidázy A vedoucí k progresivní intracelulární akumulaci neutrálních glykosfingolipidů, především globotriaosylceramidu. Kromě řady extrakardiálních manifestací je pro Fabryho chorobu typické i postižení kardiovaskulárního systému. Jeho primárním podkladem je ukládání patologického substrátu v kardiomyocytech, buňkách převodního systému, chlopenních fibroblastech a endoteliálních a svalových buňkách vaskulatury. Charakteristickým kardiovaskulárním projevem Fabryho choroby je vývoj srdeční i cévní hypertrofie. Cílem našich prací bylo pomocí ultrasonografických vyšetření, která představují základní neinvazivní zobrazovací metodu v kardiologii, podrobně popsat změny kardiovaskulárního systému u nemocných s Fabryho chorobou. Zaměřili jsme se na strukturální a funkční změny srdečních komor a chlopenního aparátu a jejich vztah k postižení vaskulárnímu, reprezentovanému nálezy na společných karotických tepnách. Dále jsme srovnali diagnostickou přesnost dvou nových ultrasonografických metod hodnocení diastolické funkce levé komory. V in vitro studii byla zkoumána možnost přítomnosti cirkulujícího proliferativního faktoru, který by souvisel s rozvojem kardiální a vaskulární...
|
|
Úloha genu ATM u karcinomu prsu
Soukupová, Jana ; Pohlreich, Petr (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Foretová, Lenka (oponent)
Incidence zhoubných nádorů prsu má v České republice z dlouhodobého hlediska zvyšující se tendenci. Vývoj nádoru je výsledkem kumulace genových alterací. Postiženy jsou geny, které se podílejí na regulaci (pozitivní i negativní) buněčného růstu a dělení. Dědičné karcinomy představují asi 5-10% všech karcinomů prsu a jsou v 60-80% případů způsobeny dědičnou mutací v hlavních predispozičních genech BRCA1 a BRCA2. V patogenezi karcinomu prsu se uplatňují i další geny s nižší penetrancí, mezi něž je řazen také gen ATM. Jedná se o tumorsupresorový gen, jehož produkt je důležitý pro opravu dvouřetězcových zlomů DNA. Cílem této práce bylo zjistit frekvenci mutací v genu ATM u dědičného karcinomu prsu v naší populaci a dále určit, do jaké míry je tento gen alterován u sporadického karcinomu prsu. To zahrnovalo navržení a optimalizaci metod pro detekci mutací, analýzu výpadků alel a metylace promotorové oblasti genu ATM. Závěrem lze říci, že gen ATM má pravděpodobně význam při vzniku dědičného karcinomu prsu u minoritní části vysoce rizikových pacientek v naší populaci, ale četnost mutací je oproti BRCA1/2 významně nižší a vzhledem k velikosti genu v současné době preventivní screening tohoto genu neprovádíme. Máme zavedenu mutační analýza genu ATM a dosud jako jediní v ČR nabízíme molekulární diagnostiku pacientům...
|
|
Aspekty genové regulace CYP3A4 v jaterní tkáni.
Krausová, Lucie ; Štaud, František (vedoucí práce) ; Mičuda, Stanislav (oponent) ; Skálová, Lenka (oponent)
1 Souhrn CYP3A4 je významným enzymem podílejícím se na eliminaci většiny biotransformovaných xenobiotik. Hraje zásadní úlohu v detoxifikačním systému lidského těla, čímž je také zodpovědný za vznik řady lékových interakcí. Tyto interakce představují výraznou komplikaci současné farmakoterapie, neboť v krajních případech mohou ústit až k selhání léčby či život ohrožujícímu vystupňování toxických účinků. LI jsou důsledkem změn aktivity CYP3A4, která je mezi jednotlivci velice variabilní. Důležitým mechanismem ovlivnění aktivity CYP3A4 je regulace indukovatelné transkripce prostřednictvím xenobiotiky aktivovaných nukleárních receptorů. Jedná se zejména o receptory PXR, CAR a GR. Intenzivní studium struktury promotoru CYP3A4 a mechanismů regulace jeho transkripce v posledních letech ještě zdaleka není u konce, vztahy mezi jednotlivými receptory a kofaktory, stejně jako schopnost léčiv zasahovat do exprese CYP3A4 je doposud odkryta jen zčásti. Tato práce přispívá k objasnění některých otázek týkajících se účinků azolových antimykotik na aktivitu transkripce CYP3A4 zprostředkovanou PXR, schopnosti valproátu aktivovat PXR a CAR či okolností placentární exprese CYP3A4 prostřednictvím GR. K experimentům byly využity moderní molekulárně biologické metody a probíhaly in vitro v kulturách primárních hepatocytů a...
|
| |
|
Technologie zmrazování spermií býků ve vztahu k jejich přežitelnosti a oplozovací schopnosti
Doležalová, Martina ; Stádník, Luděk (vedoucí práce) ; Jiří, Jiří (oponent)
Cílem optimalizace procesu výroby inseminačních dávek je zajištění co nejvyšší oplozovací schopnosti spermií v průběhu relativně náročného procesu zpracování čerstvého ejakulátu a jeho následná kryokonzervace. Zejména v průběhu chlazení a mrazení spermií dochází k jejich poškození vlivem změny teplot, kdy jsou spermie vystaveny chladovému šoku a dalším limitujícím faktorům, které mají za následek buněčnou smrt a tudíž i snižování oplozovací schopnosti následně rozmrazené inseminační dávky. Pro zvýšení odolnosti spermií, respektive plazmatické membrány, vůči chladovému šoku byla do komerčně vyráběných ředidel přidávána frakce vaječného žloutku LDL cholesterol (low density lipoprotein) v různých koncentracích, takto vyrobené dávky byly testovány pomocí chladového a tepelného testu přežitelnosti spermií. Má se za to, že LDL příznivě ovlivňuje plazmatickou membránu spermií a napomáhá k lepší oplozovací schopnosti spermií po rozmrazení. Dalším krokem v procesu výroby inseminačních dávek je pozvolné chlazení naředěného ejakulátu a ekvilibrace, kdy jsou dávky uloženy v chladicím boxu po bobu 30 minut až 24 hodin, tato doba je nezbytně nutná pro penetraci určitých komponent ředidla do spermatických buněk a nastolení balance mezi jejich intracelulární a extracelulární koncentrací. Současně je důležitý následný teplotní gradient mrazení inseminačních dávek. Jako nejvhodnější způsob mrazení je dostupný systém počítačově řízeného poklesu teplot v mrazicím boxu, který umožňuje přesnou kontrolu tvorby ledových krystalů, které by mohly roztrhat, a tím zabít buňku.
V průběhu 2012 až 2016 byl opakovaně odebírán ejakulát od skupiny plemenných býků (n=27, býci holštýnského a českého strakatého plemene) na inseminační stanici. Ejakulát splňující standardní vstupní podmínky byl v prvním kroku rovnoměrně rozdělen na několik částí. K ředění ejakulátu byly využity 3 typy komerčně vyráběných ředidel AndroMed, Bioxcell a Triladyl bez a s přídavku LDL do ředidel o koncentraci 4 až 10 % v závislosti na typu ředidla. Naředěný ejakulát byl naplněn do skleněných kapilár o objemu 0,1 ml a teplotě +4 °C a vložen na 10 minut do chladicího boxu o teplotě 0 °C. Po uplynutí stanovené doby byl objem kapiláry smíchán s fyziologickým roztokem o teplotě 37 °C, kde byl vzorek 120 minut inkubován. Byl hodnocen vliv chladového šoku na podíl živých spermií v ejakulátu pomocí barvení Eosinem a Nigrosinem v průběhu tepelného testu přežitelnosti spermií a to ihned po zahřátí vzorku a po uplynutí 120 minutové inkubace. Z výsledků bylo patrné, že vhodnějšími ředidly pro zvyšování odolnosti spermií vůči chladovému šoku byly AndroMed a Bioxcell. Současně byl také zjištěn pozitivní vliv přídavku LDL do ředidel na nižší pokles podílu živých spermií v průběhu tepelného testu (P<0,05). Jako nejvhodnější koncentrace mající příznivý vliv na odolnost spermií vůči chladovému šoku byla vyhodnocena 6% koncentrace LDL v ředidle Bioxcell, kdy byly hodnoty podílu živých spermií vyšší jak na začátku tepelného testu (+1,31 % až +3,2 %) tak po 2 hodinové inkubaci (+5,82 % až +8,41 %) oproti ostatním ředidlům bez a s přídavkem LDL.
V dalším kroku byl optimalizován proces ekvilibrace, který je důležitou součástí výroby dávek a byl vyhodnocen vliv délky ekvilibrace na následnou oplozovací schopnost spermií hodnocenou pomocí motility spermií po rozmrazení zjištěné na základě CASA a podíl živých spermií v průběhu tepelného testu přežitelnosti trvajícím 120 minut (37 °C). Vhodný ejakulát byl naředěn standardně využívaným ředidlem AndroMed na bázi sojového lecitinu, naředěný ejakulát byl naplněn do pejet (0,25 ml), zchlazen a ekvilibrován v chladicím boxu po dobu 30, 120 a 240 minut, následně byl mrazen v programovatelném mrazicím boxu dle 4 typů mrazicích křivek lišících se teplotou a rychlostí poklesu teplot v komoře. K mrazení byla využita standardně využívaná a výrobcem doporučovaná 3. fázová mrazicí křivka, dále 2. fázová mrazicí křivka, a 3. fázová mrazicí křivka s pomalejším a naopak rychlejším poklesem teplot v komoře, oproti standardní mrazicí křivce. Nejvhodnější délka ekvilibrace byla 240 minut, kde byla zjištěna motilita vyšší o +2,72 % a +4,58 % oproti ostatním délkám ekvilibrace (P<0,05 až 0,01). Nejvyšších průměrných hodnot podílu živých spermií bylo dosaženo při délce ekvilibrace 120 minut (+6,87 % a 8,68 %). Nejvyšší průměrné motility spermií po rozmrazení v průběhu tepelného testu přežitelnosti bylo dosaženo při mrazení na základě 2. fázové mrazicí křivky (od +2,97 % do +10,37 %, P<0,05), taktéž při hodnocení podílu živých spermií (od +4,37% do +8,82 %, P<0,01). Při vyhodnocení interakce mezi délkou ekvilibrace mrazicí křivkou ( 2. fázová a 3. fázová standardní) bylo nejvyšších hodnot průměrné motility a podílu živých spermií u obou křivek v kombinaci s délkou ekvilibrace 240 minut, avšak nebyl mezi nimi zaznamenán žádný statisticky průkazný rozdíl. Ve všech hodnocených částech práce byly nalezeny individuální rozdíly mezi jednotlivými býky i mezi jednotlivými odběry ejakulátu od jednoho býka (P<0,05).
Pro zachování dobré oplozovací schopnosti ejakulátu v průběhu procesu kryokonzervace je zapotřebí zvýšit odolnost spermií vůči chladovému šoku a to přidáním správné koncentrace LDL do vhodného komerčně vyráběného ředidla, kterým bylo ředidlo AndoMed a Bioxcell. Následně je ve velké míře oplozovací schopnost vyrobené inseminační dávky ovlivněna chlazením a délkou ekvilibrace před samotným mrazením. Délka ekvilibrace 120 minut a déle a následný šetrný způsob mrazení dle mrazicí křivky, která zajišťuje pozvolný pokles teplot v komoře, zajistí vyšší průměrnou motilitu spermií a podíl živých spermií po rozmrazení.
|
|
Neurogenetický potenciál kmenových buněk u myší
Slabá, Barbora ; Červený, Lukáš (oponent) ; Štaud, František (vedoucí práce)
Neurální kmenové buňky (NKB) se vyskytují v dospělém nervovém systému savců, nacházejí se ve dvou specifických oblastech: subventrikulární zóna předního mozku a subgranulární zóna gyrus dentatus v hipokampu. NKB získávají své specifické vlastnosti, vyzrávají a integrují se do funkčních celků, předtím než se mohou funkčně zapojit do nervového systému. Stále víme málo o mechanismech, které kontrolují tyto procesy a o funkci nově vznikajících neuronů v dospělém mozku. Velké množství faktorů na molekulární úrovni a vliv prostředí, to vše se může podílet na regulaci proliferace, vývoje a diferenciace somatických kmenových buněk v dospělém nervovém systému. NKB dávají vznik třem hlavním typům nervových buněk: neuronům, astrocytům a oligodendrocytům. Ukazuje se, že astrocyty mohou hrát klíčovou roli v regulaci neurogeneze: v neporušeném funkčním dospělém mozku i po jeho poškození. Pro odhalení funkce astrocytů v regulaci neurogeneze na molekulární úrovni, je nezbytným krokem nejprve porozumět regulaci neurogeneze v dospělém CNS. Abychom zjistili, jak se projeví odstranění genů intermediálních filament astrocytů (GFAP, vimentin) na počtu NKB, a jak zásah ovlivní vlastnosti neurálních kmenových buněk myší, analyzovali jsme neurosféry neurálních kmenových buněk. Neurosféry sloužili k porovnání charakteristik...
|
|
Integrated structural study of the FrpD protein from Neisseria meningitidis
SVIRIDOVA, Ekaterina
Neisseria meningitidis (N. meningitidis) is a Gram-negative commensal bacterium colonizing nasopharynx of about 10 % of healthy individuals, which can cause invasive diseases, such sepsis and meningitis, upon occasional penetration into bloodstream. Pathogenesis of N. meningitidis appears to be directly related to conditions of limited iron availability. Under these conditions two proteins of unknown function: FrpC and FrpD, are synthesized. FrpD is a highly conserved lipoprotein of N. meningitidis anchored to the bacterial outer membrane. It is known that FrpD tightly binds the FrpC protein, which belongs to the Repeat-in-Toxin (RTX) protein family and may act as bacterial exotoxin. However, the mechanism of FrpD-FrpC interaction and the exact function of this complex are unknown due to the absence of structural information on these proteins. Therefore, we set out to determine the structure of FrpD and provide insights into its interaction mechanism with FrpC and structure-functional relationships of these two proteins. We determined the first crystal and solution structures of the FrpD protein. We found that atomic structures of FrpD reveal a novel protein fold. We uncovered the structure-function relationships underlying the mechanism of interaction between the FrpD and FrpC proteins and tested the putative function of the FrpD-FrpC1-414 complex in vitro. Finally, we proposed the putative function of the FrpD-FrpC1-414 complex as a new minor adhesin of N. meningitidis, which mediates the bacterial adhesion to the host epithelial cells and facilitate the colonization. Our work constitutes the first step in clarifying the molecular basis of the FrpD-FrpC interaction and sets the base for further investigation of the role of FrpD and FrpC in the virulence mechanism of N. meningitidis.
|
|
Single cell expression analysis of genes with potential mrna gradient in mouse oocytes
Dorosh, Andriy ; Margaryan, Hasmik ; Vodička, Martin ; Ergang, Peter ; Šídová, Monika ; Dvořáková-Hortová, Kateřina
In frogs, there are clearly visible differently pigmented animal and vegetal poles of the egg determined before fertilization and leading to asymmetrical divisions. Mammalian egg does not show any comparable differentiation and it has been generally accepted that even the individual blastomeres in 2-cell and 4-cell embryos are homogenous. However, recent findings suggest that those blastomeres display different gene expression patterns and might already possess some inclinations to specific cell lineages. We therefore raised a question, whether there could be any mRNA or protein gradients in pre-fertilization oocytes similar to a previously described amphibian egg one. In mammalian eggs, there is a membrane region that is poor in microvilli, cortical granules are absent beneath plasma membrane and sperm cells generally do not bind to this location. This microvilli free region also covers the egg nucleus, and cytoskeleton localization differs markedly to the rest of the cortical space, forming actin –myosin II cortical cap/ring and is considered as animal pole. The purpose of this study was to determine gene products that can be detected at single cell level using qPCR and display gradient like distribution in mature oocytes. We checked expression of 12 selected genes in a pool of 10 oocytes and single mature oocytes. Then, we analysed gene expression in fixed intact oocytes and those undergoing laser capture microdissection procedure (LCMD). Eventually, we have determined six candidate genes for the study of intracellular spatial gene expression in mature mammalian oocytes by subcellular qPCR and in situ hybridization.
|
|
Estrogen receptor beta (ERβ) in testicular cells and sperm
Dostálová, Pavla ; Žatecká, Eva ; Děd, Lukáš ; Dorosh, Andriy ; Postlerová, Pavla ; Jonáková, Věra ; Dvořáková-Hortová, Kateřina ; Pěknicová, Jana
Estrogen is a steroid hormone that plays an important role during sperm development in the male and female reproductive tract. Estrogen signalling is a complex process that depends on cell milieu and presence of receptors. Thanks to the steroid nature of estrogens, they can pass through the plasmatic membrane and bind to the intracellular estrogen receptors (ERs). Within the cell, there are several pools of ERs. One of them is localized to the cell nucleus and their activation leads to direct or indirect binding to DNA and ultimately to alternation in gene expression (genomic pathway). Other pools of ERs are associated with plasma membrane or are located in cytosol. Activation of membrane associated ERs leads to rapid non-genomic responses. Nowadays, two classical estrogen receptors are known – ERα and ERβ. Since ERβ is a predominant variant in testes, we focused our study on expression of ERβ variants in murine testes and sperm. We detected two variants of ERβ at mRNA level in both, testes and sperm. These variants differ in 54 nucleotids within the ligand binding domain and this variability results in different affinity to estrogen. We analyzed individual testicular cell types (spermatogonia, spermatocytes, spermatids, Sertoli cells) by RT-qPCR. Our results suggest that both ERβ variants are coexpressed in the same cell type and may therefore interact together. This may have consequences in mediating of estrogen signalling. Moreover, ERβ is expressed more in the later stages of spermatogenesis suggesting the role of ERβ in these stages or alternatively in spermatozoa alone. At the protein level, we detected ERβ in nuclear, membrane and cytosolic fraction prepared from testicular tissue suggesting the involvement of both, genomic and non-genomic, pathways of estrogen signaling in testes. In sperm, anti-ERβ antibodies localized ERβ in acrosome region and tail which is in accordance with the known role of estrogen on capacitation, acrosome reaction and motility.
|
host ::
