|
|
Příprava a charakterizace neutrální trehalasy pro strukturní studie
Šmídová, Aneta ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Jiráček, Jiří (oponent)
Předkládaná diplomová práce je součástí projektu, jehož cílem je vyřešení struktury trehalasové domény neutrální trehalasy Nth1 pocházející ze Saccharomyces cerevisiae. Hlavním cílem této diplomové práce je příprava nových konstruktů kvasničné Nth1 a optimalizace jejich purifikačních protokolů, dále pak výběr nejvhodnějšího pufru pro hledání krystalografických podmínek pomocí metody diferenční skenovací fluorimetrie (DSF) a následná krystalizace připraveného proteinu. Další částí diplomové práce je stanovení enzymové aktivity Nth1 WT a jejích mutantních forem za přítomnosti proteinu Bmh1, dále pak ověření vazby trehalosy na vybrané konstrukty Nth1 pomocí DSF a mikrotermoforézy (MST) a následná krystalizace s trehalosou. Neutrální trehalasa se řadí mezi vysoce konzervované trehalasy, které byly objeveny v široké škále organismů. Tyto enzymy patří do třídy hydrolas, podskupiny glykosidas, hydrolyticky štěpí molekulu trehalosy na dvě molekuly glukosy. Trehalosa je přirozeně se vyskytující neredukující disacharid, který slouží v buňkách kvasinek jako zdroj uhlíku a energie a dále jako ochrana před stresy jako je např. tepelný šok. Hydrolýza trehalosy je životně důležitá pro létavý hmyz, neboť je přítomná jako hlavní cukerná složka hemolymfy hmyzu, proto inhibitory trehalas mohou být využity jako...
|
|
|
High-throughput screening for the discovery of small molecules modulating cell fate
Ribeiro Pombinho, António José ; Bartůněk, Petr (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Jiráček, Jiří (oponent)
Objevy sloučenin ovlivňujících buněčnou proliferaci, diferenciaci a smrt mohou vést nejen ke vzniku nových léčiv sloužících k léčbě či prevenci onemocnění, ale lze je také využít ke studiu molekulárních drah zapojených v těchto procesech. Pro testování tisíců těchto malých molekul v buněčných esejích je nezbytná přístrojová automatizace a miniaturizace. V této práci jsou popsány postupy testování s vysokou propustností (HTS). Jako hlavní předměty studia byly vybrány dráhy hypoxie a Wnt zapojené v růstu kmenových a nádorových buněk, diferenciace hematopoetických, neurálních a mesenchymálních kmenových buněk, a dráha TRAIL vedoucí k selektivní likvidaci nádorových buněk. Tímto postupem bylo možné testovat efekt malých molekul v eukaryotických buňkách a jednobuněčných organismech, jak je ilustrováno na příkladu hledání sloučenin účinkujících proti parazitickým prvokům rodu Leishmania. Několik sloučenin se ukázalo být aktivními modulátory osudu buňky. Jednalo se především o monensin, který inhibuje dráhu Wnt a zabraňuje růstu nádorů v myším modelu kolorektálního karcinomu, hemoharringtonin, který ve spolupráci s proteinem TRAIL indukuje smrt rakovinných buněk implantovaných do imunodeficientní myši, a diphenyleneiodonium chlorid, jenž zabíjí Leishmanie v buňkách. Žádná z těchto látek není v...
|
|
|
Specifika kolektivizace na okrese Svitavy v letech 1949-1960
Jiráček, Jiří ; Jančík, Drahomír (vedoucí práce) ; Jakubec, Ivan (oponent)
Tato práce se zabývá procesem kolektivizace na území spadajícím do kompetence Okresního národního výboru Svitavy. Práce představuje hospodářskou i sociální přeměnu regionu po odsunu německých obyvatel. První kapitola podává obecnou charakteristiku okresu Svitavy a také ONV Svitavy jako hlavního prostředníka kolek- tivizace mezi vládou a jednotlivými obcemi. Další kapitola se soustředí na průběh kolektivizace na Svitavsku, a to podle dělení na tři etapy - první etapa (1949-1953), druhá etapa (1953-1954) a závěrečná etapa (1954-1960). Regionální vývoj je zasazen do souvislostí s celorepublikovými událostmi spojenými s fenoménem kolektivizace. Následující kapitola se věnuje individuálnímu průběhu kolektivizace ve vybraných obcích okresu Svitavy. Autor se pokouší na základě mikro-historických sond pouká- zat na zvláštnosti provázející realizaci kolektivizace. Cílem poslední kapitoly je na- stínění mechanismu soudních represí proti soukromým rolníkům. Pozornost se pře- devším upíná k největšímu rolníkovi Františku Blažkovi. Soudní proces s ním se stal zastrašujícím nástrojem k urychlení likvidace tzv. "kulaků". Práce si klade za cíl vylíčit rozdílnosti v zakládání jednotných zemědělských družstev mezi obcemi nově osídle- nými a s původním obyvatelstvem. Okres Svitavy se k tomuto porovnání velmi hodí,...
|
|
|
Syntéza a charakterizace nových analogů insulinu s cílem objasnit interakci insulinu s jeho receptorem
Kletvíková, Emília ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Hrabal, Richard (oponent)
Tato disertační práce je zaměřena na studium insulinových analogů modifikovaných na C-konci B-řetězce s cílem sledovat vliv vložené mutace na dimerizaci insulinu a interakci s insulinovým receptorem (IR). Připraveny byly analogy s modifikacemi v pozicích B24-B26, kde byly do peptidového řetězce syntetickými a semisyntetickými metodami vloženy kódované i nekódované aminokyseliny. Studovány byly jak analogy plné délky, tak analogy zkrácené o tři až čtyři C- koncové aminokyseliny. Metodou kompetice analogu s radioaktivním (125I) lidským insulinem byla určena vazebná afinita k receptoru. Metodou isotermální titrační mikrokalorimetrie byla určena dimerizační schopnost analogů, a to zejména analogů s N- methylovanou peptidovou vazbou v pozicích B23-B24, B24-B25 a B25-B26. Metodou rentgenové krystalografie a metodou nukleární magnetické resonance byly určeny struktury vybraných analogů. Tyto struktury byly konfrontovány s vazebnou afinitou analogů s cílem charakterizovat aktivní konformaci insulinu. Charakterizovány byly analogy vykazující jak vyšší, tak i ekvipotentní či nižší vazební afinitu k IR. Výsledky krystalových struktur ukazují, že pro vazbu na receptor je důležité zachování určitého stupně ...
|
|
|
The metabolism and signaling of hydrogen sulfide: the role of CBS-related proteins in Caenorhabditis elegans
Vozdek, Roman ; Kožich, Viktor (vedoucí práce) ; Macůrková, Marie (oponent) ; Jiráček, Jiří (oponent)
Sirovodík (H2S) je toxický plyn, který ve vysokých koncentracích způsobuje respirační selhání a smrt organismu, zatímco v nízkých koncentracích hraje roli jako vasodilatátor, neuromodulátor, a chrání buňky a tkáně před reperfuzním poškozením, hypoxií, hyperglykémií či dysfunkcí endotelu. Ke studiu fyziologie a signalizace H2S je využíváno hned několik modelových organismů. Hlístice Caenorhabditis elegans je pozoruhodným modelem ke studiu fyziologie, vývojové biologie, a v neposlední řadě i signalizace H2S, nicméně metabolismus sirovodíku v tomto organismu není známý. Cystathionin-beta-synthasa (CBS) je jedním ze tří enzymů produkujících H2S u živočichů. Zajímavé je, že u C. elegans je postulováno hned šest genů kódující homologní proteiny k CBS (cbs-1, cbs-2, cysl-1, cysl -2, cysl -3 a cysl -4). Cílem této práce bylo zjistit funkci těchto genů v metabolismu a signalizaci H2S u C. elegans. Nejprve jsme identifikovali cbs-1 jako gen kódující CBS; rekombinantní purifikovaný protein CBS-1 vykázal CBS aktivitu a RNA interference cbs-1 vedla ke snížené CBS aktivitě a zvýšené hladině homocysteinu v červích homogenátech, což rekapituluje deficit CBS u savců. Je zajímavé, že hlístí a savčí CBS mají odlišnou doménovou architekturu a tedy i posttranslační regulaci. Dále jsme zjistili, že ostatní proteiny...
|
|
|
Studium fyziologických funkcí betain homocystein S-methyltransferasy a betain homosystein S-methyltransferasy 2
Mládková, Jana ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent) ; Kožich, Viktor (oponent)
Betain homocystein S-methyltransferasa (BHMT) a betain homocystein S-methyltransferasa 2 (BHMT-2) jsou dva savčí cytozolické metaloenzymy. Oba tyto enzymy se účastní metabolizmu homocysteinu (Hcy), konkrétně jeho remethylace, především v jaterních a také ledvinných buňkách. BHMT přenáší methylovou skupinu z betainu na L-Hcy za vzniku L-methioninu a dimethylglycinu (DMG). BHMT-2 přenáší methylovou skupinu z S-methylmethioninu (SMM) také na L-Hcy za vzniku dvou molekul L-methioninu. Poruchy v metabolizmu Hcy mohou vést k tzv. hyperhomocysteinemii nebo homocystinurii, které mohou mít souvislost s řadou patologických stavů. BHMT je již relativně dobře prozkoumaným enzymem. Je známa její krystalová struktura, reakční mechanizmus, připravena byla řada inhibitorů tohoto enzymu, které umožnily také in vivo studie, a nedávno se po dlouhé době podařilo vyvinout Bhmt-/- myší model. Výzkum BHMT-2 je oproti tomu teprve v začátcích a fyziologické funkce BHMT-2 zůstávají stále neznámé. Důvodem je velká nestabilita BHMT-2 a také absence selektivních inhibitorů. BHMT a BHMT-2 jsou velmi podobné enzymy, které mají 73% identitu v primární sekvenci. Výsledky této dizertační práce poskytují nové informace o vlastnostech a strukturních požadavcích aktivního centra BHMT. Tyto informace byly získány pomocí třiceti nově...
|
|
|
Studium fyziologických funkcí betain homocystein S-methyltransferasy a betain homosystein S-methyltransferasy 2
Mládková, Jana ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce)
Betain homocystein S-methyltransferasa (BHMT) a betain homocystein S-methyltransferasa 2 (BHMT-2) jsou dva savčí cytozolické metaloenzymy. Oba tyto enzymy se účastní metabolizmu homocysteinu (Hcy), konkrétně jeho remethylace, především v jaterních a také ledvinných buňkách. BHMT přenáší methylovou skupinu z betainu na L-Hcy za vzniku L-methioninu a dimethylglycinu (DMG). BHMT-2 přenáší methylovou skupinu z S-methylmethioninu (SMM) také na L-Hcy za vzniku dvou molekul L-methioninu. Poruchy v metabolizmu Hcy mohou vést k tzv. hyperhomocysteinemii nebo homocystinurii, které mohou mít souvislost s řadou patologických stavů. BHMT je již relativně dobře prozkoumaným enzymem. Je známa její krystalová struktura, reakční mechanizmus, připravena byla řada inhibitorů tohoto enzymu, které umožnily také in vivo studie, a nedávno se po dlouhé době podařilo vyvinout Bhmt-/- myší model. Výzkum BHMT-2 je oproti tomu teprve v začátcích a fyziologické funkce BHMT-2 zůstávají stále neznámé. Důvodem je velká nestabilita BHMT-2 a také absence selektivních inhibitorů. BHMT a BHMT-2 jsou velmi podobné enzymy, které mají 73% identitu v primární sekvenci. Výsledky této dizertační práce poskytují nové informace o vlastnostech a strukturních požadavcích aktivního centra BHMT. Tyto informace byly získány pomocí třiceti nově...
|
|
|
Molecular mechanisms in homocystinuria: spatial arrangement of human cystathionine β-synthase
Hnízda, Aleš ; Kožich, Viktor (vedoucí práce) ; Holada, Karel (oponent) ; Jiráček, Jiří (oponent)
Chybné sbalování proteinů je považováno za hlavní patogenetický mechanismus homocystinurie z deficitu cystathionin beta-synthasy (CBS). Cílem této práce bylo studium molekulových mechanismů, které vedou k chybnému sbalování mutantních forem CBS. V první části práce jsme studovali prostorové uspořádání normální lidské CBS. Pomocí diferenčního kovalentního značení povrchově dostupných aminokyselinových zbytků jsme identifikovali kontaktní plochu mezi katalytickým jádrem a regulační doménou v lidské CBS a následně jsme navrhli strukturní model plnodélkového enzymu. V další části práce jsme studovali evoluční divergenci proteinových struktur CBS. Provedli jsme fylogenetickou analýzu, která odhalila unikátní uspořádání pro CBS z třídy nematod; doménová architektura CBS z Caenorhabditis elegans byla podrobně studována experimentálně. Nakonec jsme studovali konformační vlastnosti vybraných mutantních forem lidské CBS, které měly do různé míry narušenou tvorbu tetrameru a sníženou enzymovou aktivitu. Pomocí proteolytických technik s využitím thermolysinu jsme analyzovali devět mutantních forem, které byly exprimovány v E.coli. Zjistili jsme, že rozbalení struktury je běžným jevem při chybném sbalování mutantních CBS. Důležitost rozbalení proteinů pro patogenesi deficitu CBS byla dále prokázána pomocí...
|
|
|
Chiral analysis of beta-alanyl-D,L-tyrosine and its derivatives by capillary electrophoresis with 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin stereoselector
Sázelová, Petra ; Šolínová, Veronika ; Schimperková, Tereza ; Mášová, Alice ; Jiráček, Jiří ; Kašička, Václav
A new capillary electrophoretic method was developed for separation of enantiomers of antimicrobial dipeptide betha-Ala-D,L-Tyr and its derivatives using 50 mM Tris-phosphate, pH 2.50, as background electrolyte and 2-hydroxypropyl-betha-cyclodextrin at concentrations 20 – 60 mg/mL as chiral selector. In addition, association constants of complexes of the enatiomers of dipeptide betha-Ala-D,L-Tyr and its derivatives with 2-hydroxypropyl-betha-cyclodextrin chiral selector were determined.
|
|
|
Capillary electrophoresis applied to analysis and characterization of mono-N-acyl-2,6-diaminopimelic acid derivatives
Vítovcová, M. ; Hlaváček, Jan ; Pícha, Jan ; Vaněk, Václav ; Jiráček, Jiří ; Kašička, Václav
Capillary zone electrophoresis and micellar electrokinetic chromatography have been employed for determination of electrophoretic purity degree, limit of detection and limit of quantification of twelve mono-Nacylated derivatives of 2,6-diaminopimelic acid (DAP). In addition, the DAP derivatives were characterized by effective electrophoretic mobilities of their cationic and anionic forms in several classical and isoelectric buffer-based background electrolytes within a broad pH range 2.18 – 8.64.
|
host ::
RSS.