|
|
Molecular mechanisms in homocystinuria: spatial arrangement of human cystathionine β-synthase
Hnízda, Aleš ; Kožich, Viktor (vedoucí práce) ; Holada, Karel (oponent) ; Jiráček, Jiří (oponent)
Chybné sbalování proteinů je považováno za hlavní patogenetický mechanismus homocystinurie z deficitu cystathionin beta-synthasy (CBS). Cílem této práce bylo studium molekulových mechanismů, které vedou k chybnému sbalování mutantních forem CBS. V první části práce jsme studovali prostorové uspořádání normální lidské CBS. Pomocí diferenčního kovalentního značení povrchově dostupných aminokyselinových zbytků jsme identifikovali kontaktní plochu mezi katalytickým jádrem a regulační doménou v lidské CBS a následně jsme navrhli strukturní model plnodélkového enzymu. V další části práce jsme studovali evoluční divergenci proteinových struktur CBS. Provedli jsme fylogenetickou analýzu, která odhalila unikátní uspořádání pro CBS z třídy nematod; doménová architektura CBS z Caenorhabditis elegans byla podrobně studována experimentálně. Nakonec jsme studovali konformační vlastnosti vybraných mutantních forem lidské CBS, které měly do různé míry narušenou tvorbu tetrameru a sníženou enzymovou aktivitu. Pomocí proteolytických technik s využitím thermolysinu jsme analyzovali devět mutantních forem, které byly exprimovány v E.coli. Zjistili jsme, že rozbalení struktury je běžným jevem při chybném sbalování mutantních CBS. Důležitost rozbalení proteinů pro patogenesi deficitu CBS byla dále prokázána pomocí...
|
|
|
Vývoj alternativních proteolytických postupů pro identifikaci proteinu
Jirečková, Barbora ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Hnízda, Aleš (oponent)
4 Abstrakt Metody výzkumu proteinů založené na hmotnostní spektrometrii přibývají v posledních letech na svém významu. Pro takzvaný bottom-up přístup je zásadní proteolytický krok, který určuje úspěšnost a relevanci identifikace a charakterizace proteinu, sekvenční pokrytí a ve vodík/deuteriové výměně spojené s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS) prostorové rozlišení. Běžně používané proteázy mají ale své limitace. Z tohoto důvodu je snahou najít alternativy, které mají především jiné štěpné preference a aktivitní profil. AnPEP proteáza (prolyl endoproteáza z Aspergillus niger) je výhodná v tom, že je možné ji získat komerčně ve velkém množství a vyznačuje se štěpením za prolinem, v blízkosti kterého mnohé proteázy neštěpí. Tato práce se zabývá optimalizací štěpení AnPEP proteázou získanou z komerčního preparátu Gluten Rid with Tolerase G. Nejprve bylo provedeno štěpení AnPEP proteázou za různých podmínek na modelovém proteinu (bovinní karbonická anhydráza 2) a snahou bylo zjistit, jak se při změně podmínek (teploty, pH, koncentrace proteázy na nosiči nebo v roztoku) mění efektivita štěpení a štěpné preference této proteázy. Provedené experimenty ukázaly, že je AnPEP vhodný pro vodík/deuteriovou výměnu spojenou s hmotnostní spektrometrií v imobilizované formě i v roztoku. Naopak méně vhodný je z důvodu...
|
|
|
Study of conformations and conformational changes of proteins using mass spectrometric methods.
Kádek, Alan ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Hnízda, Aleš (oponent)
Hmotnostně spektrometrické (MS) techniky si v průběhu posledních dvou desetiletí našly své trvalé místo mezi nástroji strukturní biologie. Kromě získání informace o primární sekvenci proteinů jsou stále častěji využívány i pro studium vyšší strukturní organizace bílkovin. Nedosahují sice atomárního prostorového rozlišení, jsou ale naopak prosty řady experimentálních omezení. MS strukturní techniky tak jsou schopny studovat molekuly za nativních podmínek v roztoku, jsou rychlé, mají nízkou spotřebu vzorku a jsou použitelné pro molekuly a jejich komplexy s velmi širokým rozsahem velikostí. Možná nejdůležitější je však jejich schopnost poskytnout informace o konformační dynamice proteinů, které tak mohou doplnit data získaná jinou strukturní technikou s vyšším prostorovým rozlišením v rámci integrativní strukturní biologie. V této disertační práci byla hlavní pozornost věnována technice vodík / deuteriové výměny v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (HXMS), která je jednou z nejvíc rozšířených strukturních MS metod. Rekombinantně připravená aspartátová proteasa nepenthesin-1 z láčkovek rodu Nepenthes byla charakterizována, imobilizována a podrobně testována s cílem rozšířit portfolio proteas dostupných pro HXMS experimenty a zvýšit prostorové rozlišení této techniky. Po úspěšné implementaci do HXMS...
|
|
|
Molecular mechanisms in homocystinuria: spatial arrangement of human cystathionine β-synthase
Hnízda, Aleš ; Kožich, Viktor (vedoucí práce) ; Holada, Karel (oponent) ; Jiráček, Jiří (oponent)
Chybné sbalování proteinů je považováno za hlavní patogenetický mechanismus homocystinurie z deficitu cystathionin beta-synthasy (CBS). Cílem této práce bylo studium molekulových mechanismů, které vedou k chybnému sbalování mutantních forem CBS. V první části práce jsme studovali prostorové uspořádání normální lidské CBS. Pomocí diferenčního kovalentního značení povrchově dostupných aminokyselinových zbytků jsme identifikovali kontaktní plochu mezi katalytickým jádrem a regulační doménou v lidské CBS a následně jsme navrhli strukturní model plnodélkového enzymu. V další části práce jsme studovali evoluční divergenci proteinových struktur CBS. Provedli jsme fylogenetickou analýzu, která odhalila unikátní uspořádání pro CBS z třídy nematod; doménová architektura CBS z Caenorhabditis elegans byla podrobně studována experimentálně. Nakonec jsme studovali konformační vlastnosti vybraných mutantních forem lidské CBS, které měly do různé míry narušenou tvorbu tetrameru a sníženou enzymovou aktivitu. Pomocí proteolytických technik s využitím thermolysinu jsme analyzovali devět mutantních forem, které byly exprimovány v E.coli. Zjistili jsme, že rozbalení struktury je běžným jevem při chybném sbalování mutantních CBS. Důležitost rozbalení proteinů pro patogenesi deficitu CBS byla dále prokázána pomocí...
|
host ::
RSS.