|
|
Vývoj a implementace nových přístupů umožňujících proteomickou charakterizaci kostních tkání ve stomatochirurgii
Michalus, Iva ; Hynek, Radovan (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Hrabal, Richard (oponent)
1 Abstrakt Proteomika je bouřlivě se rozvíjející obor, který nachází uplatnění v mnoha oblastech medicíny, včetně stomatologie. Přesto proteomická charakterizace kostních tkání ve stomatochirurgii není stále běžně využívána. Hlavní příčinou je značná komplikovanost používaných analytických přístupů, která vyplývá z nerozpustného charakteru kostních tkání. Cílem této práce bylo vyvinout a aplikovat přímočarou metodiku, která by mohla vést k rutinnímu využití proteomiky i v této oblasti. Nejprve byla s využitím prasečích čelistních kostí jako modelových vzorků vyvinuta technika umožňující identifikovat až stovky proteinů díky jejich štěpení trypsinem přímo v kostních tkáních ("in-bone digestion") následovaného analýzou pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie s předřazenou kapalinovou chromatografií (LC-MS/MS). Tato technika byla následně aplikována na analýzu odoperovaných tkání lidských maxilárních a mandibulárních kostních tkání. Jak ve vzorcích maxilárních, tak mandibulárních kostí, bylo možné technikou přímého štěpení identifikovat značné množství proteinů. Navíc matematická analýza získaných dat umožnila též rozlišit mezi tkáněmi postiženými zánětem a zdravými tkáněmi. Přístup založený na přímém štěpení byl následně úspěšně rozšířen též na analýzu in vitro modelů lidských kostních tkání. Přímé štěpení...
|
|
|
Development of new methodology for accurate determination of molecular geometry
Socha, Ondřej ; Dračínský, Martin (vedoucí práce) ; Munzarová, Markéta (oponent) ; Hrabal, Richard (oponent)
Práce využívá kombinaci přístupů jaderné magnetické rezonance (NMR) a výpočet- ních metod ke zkoumání chemických jevů, které ovlivňují strukturu molekul v pevném, kapalném a plynném stavu. V pevné fázi se výzkum zaměřuje na kvadrupólové kaplingy chlóru a jejich využití při strukturní analýze, přičemž se opírá o metody NMR v kom- binaci s teorií funkcionálu hustoty (DFT) pro interpretaci dat. V kapalné fázi je analy- zována tautomerní přeměna isocytosinu, kde NMR nachází uplatnění při analýze složitých chemických výměn. Studie v plynné fázi zkoumá dimerizaci kyseliny octové, objasňuje dříve publikované nesrovnalosti a zhodnocuje výpočetní přístupy z hlediska predikce molekulárních struktur a vlastností molekul. Kombinace NMR a výpočetních technik byla klíčová pro vyřešení stávajících rozporů a pro hlubší pochopení chemických systémů. Výsledky vyzdvihují význam pečlivé interpretace dat a zdůrazňují silné stránky, ale i omezení kombinovaných technik. 1
|
|
|
Structural Interpretation of NMR Spectroscopic Parameters in Nucleic Acids
Fukal, Jiří ; Sychrovský, Vladimír (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Munzarová, Markéta (oponent)
Název: Strukturní interpretace NMR spektroskopických parametrů v nukleových kyselinách Autor: Mgr. Jiří Fukal Vedoucí: Dr. Vladimír Sychrovský Instituce: Univerzita Karlova, Matematicko-fyzikální fakulta a Akademie věd České republiky, Ústav organické chemie a biochemie Abstrakt: Nukleární magnetická rezonance (NMR) je spektroskopická technika široce používaná v mnoha oblastech moderního výzkumu. NMR spektroskopie je nepostradatelná při určování chemické a 3D struktury molekul. Zejména 1 H a 13 C NMR měření se staly základním nástrojem pro charakterizaci peptidů, proteinů a nukleových kyselin. 15 N a 17 O NMR experimenty většinou vyžadují zavedení těchto atomů/izotopů na příslušná místa v molekulách z důvodu jejich nízkého přirozeného zastoupení a tedy i nižší citlivosti měření. Měření 31 P NMR spekter se tedy nabízí jako velmi vhodná vzhledem ke 100 % přirozeného zastoupení tohoto izotopu. 31 P NMR studie nukleových kyselin se přirozeně zaměřují na fosfátovou skupinu páteře. Příslušné spektrální parametry zahrnují zejména δ31P NMR chemický posun a J spin-spin konstantu související s chemickou vazbou zahrnující atom fosforu (např. 3 JP,H3'). Pro teoretické výpočty 31 P NMR parametrů je nutné použít adekvátní kvantově mechanickou metodu (QM metodu) a zahrnout efekty v důsledku molekulové dynamiky (MD)....
|
|
|
Characterization of protein-protein interactions between Forkhead box O (FOXO) and p53 transcription factors
Mandal, Raju ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Transkripční faktor p53 hraje klíčovou roli v regulaci buněčného cyklu, opravě DNA, apoptóze, obraně před nádorovými onemocněními a udržování buněčné homeostázy. Při buněčném stresu p53 přímo interaguje s transkripčním faktorem Forkhead box O (FOXO) 4, čímž zvyšuje expresi proteinu p21, což vede k indukci buněčné senescence. Molekulární mechanismus interakce těchto dvou klíčových transkripčních faktorů však zůstává nejasný kvůli absenci strukturních dat. Hlavním cílem této dizertační práce byla strukturní charakterizace interakce mezi FOXO4 a p53 prostřednictvím několika biofyzikálních technik včetně metody sedimentační rychlosti analytické ultracentrifugace (SV AUC), nukleární magnetické rezonance (NMR), chemického zesítění spojeného s hmotnostní spektrometrií. Dále byla studována DNA vazebná afinita obou proteinů k jejich příslušným konsenzuálním DNA sekvencím v přítomnosti nebo nepřítomnosti jejich vazebných partnerů a byl porovnán p53-vazebný povrch Forkhead domény tří různých FOXO proteinů. Připravené proteiny byly také použity pro optimalizaci nízkomolekulárních sloučenin umožňujících inhibici interakce mezi FOXO3 a DNA. Získané výsledky ukázaly, že p53 interaguje s FOXO4 prostřednictvím komplexních přechodných interakcí zahrnujících strukturované i neuspořádané oblasti obou proteinů. NMR...
|
|
|
Determination of structure and dynamics of biomolecules by theoretical calculations of NMR spectroscopic parameters
Benda, Ladislav ; Sychrovský, Vladimír (vedoucí práce) ; Munzarová, Markéta (oponent) ; Hrabal, Richard (oponent)
iii Abstrakt Název: Určování strukturních a dynamických vlastností biomolekul pomocí teoretických výpočtů parametrů spekter NMR Autor: Ladislav Benda, ladislav.benda@gmail.com Katedra/Ústav: Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i. Vedoucí doktorské práce: Dr. Vladimír Sychrovský, Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i., vladimir.sychrovsky@uochb.cas.cz Abstrakt: Předkládaná doktorská práce se zaměřuje na teoretické modelování parametrů spekter nukleární magnetické rezonance (NMR) v peptidech a nukleových kyselinách. Mo- delovány byly především závislosti NMR parametrů na molekulární struktuře a solvataci. Velký důraz byl kladen na porovnání vypočtených dat s experimentem. Studovanými modely byly především di-peptid l-alanyl-l-alanin (AA) a fosfátová skupina páteře nuk- leových kyselin. Na základě výpočtů se podařilo určit konformace všech tří nabitých forem AA v roztoku a vysvětlit experimentálně pozorované změny NMR parametrů při změnách pH. Byly kalibrovány závislosti NMR kros-korelovaných relaxačních rychlostí na geometrii molekuly AA. 31 P NMR parametry ve fosfátu nukleových kyselin byly systema- ticky modelovány v závislosti na konformaci a solvataci fosfátu. Navrhli jsme pravidla pro...
|
|
|
Měření C-13 NMR relaxací karbonylových skupin v proteinech
Grocký, Marián ; Hrabal, Richard (oponent)
Název práce: Měření 13 C NMR relaxací karbonylových skupin v proteinech Autor: Marián Grocký Katedra (ústav): Katedra fyziky nízkých teplot Vedoucí diplomové práce: RNDr. Jan Lang, PhD. Email vedoucího: Jan.Lang@mff.cuni.cz Abstrakt: V práci je zkoumána metodika měření karbonylových 13 C NMR relaxačních dob T1 a T2 v peptidovém řetězci dvojitě (13 C 15 N) značeného proteinu. Výsledky jsou použity ke stanovení dynamických vlastností matrixového proteinu (MA) Mason- Pfizerova opičího viru pomocí Lipari-Szabóova modelu (L.-S.). Mason-Pfizerův opičí virus je ve své přirozené formě retrovirus typu D. Záměna argininu za fenylanin na 55. pozici v matrixovém proteinu vede ke změně životního cyklu, retrovirus je potom typu C, stejně jako například virus HIV. V práci je porovnána dynamika MA přirozené (WT) i mutované formy (R55F) získaná L.-S. přistupem z relaxací karbonylů a z provedených relaxačních experimentů T1, T2, NOE amidických dusíků 15 N. Byla pozorovnána dobrá shoda dynamických parametrů dusíku 15 N a karbonylů 13 C, které doposud nebyly známy. Práce významně rozšířila dostavadní znalost dynamiky dusíků u WT i R55F forem matrixového proteinu. U MA proteinu R55F byla potvrzena zvýšená pohyblivost oblasti proteinu pravděpodobně zodpovědné za změnu živontího cyklu. Klíčová slova: Nukleární magnetická...
|
|
|
Syntéza a charakterizace nových analogů insulinu s cílem objasnit interakci insulinu s jeho receptorem
Kletvíková, Emília ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Hrabal, Richard (oponent)
Tato disertační práce je zaměřena na studium insulinových analogů modifikovaných na C-konci B-řetězce s cílem sledovat vliv vložené mutace na dimerizaci insulinu a interakci s insulinovým receptorem (IR). Připraveny byly analogy s modifikacemi v pozicích B24-B26, kde byly do peptidového řetězce syntetickými a semisyntetickými metodami vloženy kódované i nekódované aminokyseliny. Studovány byly jak analogy plné délky, tak analogy zkrácené o tři až čtyři C- koncové aminokyseliny. Metodou kompetice analogu s radioaktivním (125I) lidským insulinem byla určena vazebná afinita k receptoru. Metodou isotermální titrační mikrokalorimetrie byla určena dimerizační schopnost analogů, a to zejména analogů s N- methylovanou peptidovou vazbou v pozicích B23-B24, B24-B25 a B25-B26. Metodou rentgenové krystalografie a metodou nukleární magnetické resonance byly určeny struktury vybraných analogů. Tyto struktury byly konfrontovány s vazebnou afinitou analogů s cílem charakterizovat aktivní konformaci insulinu. Charakterizovány byly analogy vykazující jak vyšší, tak i ekvipotentní či nižší vazební afinitu k IR. Výsledky krystalových struktur ukazují, že pro vazbu na receptor je důležité zachování určitého stupně ...
|
|
|
Studium struktury a interakcí vybraných forkhead transkripčních faktorů
Kohoutová, Klára ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent)
Tato magisterská práce vznikla jako součást projektu, jehož cílem je vývoj a studium nízkomolekulárních látek schopných inhibovat aktivitu transkripčního faktoru FOXO3. FOXO3 tvoří spolu s FOXO1, FOXO4 a FOXO6 FOXO podrodinu forkhead rodiny transkripčních faktorů. FOXO transkripční faktory jsou evolučně konzervované proteiny, které se účastní regulace celé řady buněčných dějů, mezi něž spadá regulace apoptózy, buněčného cyklu a metabolismu. Díky své proapototické funkci a schopnosti blokovat buněčný cyklus jsou FOXO proteiny považovány za tumorové supresory. Nicméně se ukazuje, že jejich zvýšená aktivita souvisí s mnoha typy rakovinného bujení. FOXO proteiny působí jako regulátory buněčné homeostáze, zvyšují odolnost nádorů vůči chemoterapii a podporují jejich růst. Cílem tohoto projektu je vyvinout specifické inhibitory schopné vázat se na DNA-vazebnou doménu, zkráceně DBD (z angl. DNA-binding domain, residua 156-269), FOXO3 a znemožnit tak její vazbu na DNA. Vývoj specifických inhibitorů FOXO3 vyžaduje znalost struktury DBD všech FOXO proteinů a detailní znalost jejich interakce s DNA. Doposud jsou známy struktury komplexů DNA s DBD FOXO1, FOXO3, FOXO4 a struktury volných DBD FOXO3 a FOXO4. V této práci byla vyřešena struktura volné DBD FOXO1. V předchozí práci byla studována sloučenina S9, která...
|
|
|
Strukturní studie mutantu S6A matrixového proteinu Mason-Pfizerova opičího viru
Kamal, Rašíd ; Hrabal, Richard (vedoucí práce) ; Ulbrich, Pavel (oponent)
Mason-Pfizerův opičí virus (M-PMV) patří k retrovirům morfogenetického typu D, které sestavují virové částice v cytoplazmě. Tím je tento proces časově a prostorově oddělen od pučení na cytoplazmatické membráně, a proto M-PMV představuje vhodný modelový organismus pro studium životního cyklu retrovirů. Matrixový protein, který je N-terminální částí polyproteinového retrovirového prekurzoru Gag, hraje v tomto životním cyklu ústřední úlohu. Jednou z oblastí, která je pro jeho funkce klíčová, je jeho myristoylovaný N-konec, důležitý zejména pro vazbu na cytoplazmatickou membránu při pučení z hostitelské buňky. Mezi serinem 6 a glutamátem 9 divokého typu tohoto proteinu je vodíková vazba, jejíž vliv na strukturu a molekulární mechaniku této oblasti jsme studovali narušením zmíněné interakce výměnou serinu 6 za alanin. Tato práce popisuje přípravu rekombinantního, mutantního matrixového proteinu M-PMV, přiřazení rezonancí atomů jeho páteře nukleární magnetickou rezonanční spektroskopií a zjištěnou sekundární strukturu porovnává s dalšími mutanty a divokým typem.
|
|
|
Interactions in solutions and gels of stimuli-responsive polymer systems investigated by NMR spectroscopy
Konefał, Rafał ; Spěváček, Jiří (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Štěpánek, Miroslav (oponent)
Na podněty reagující (na podněty citlivé nebo inteligentní) polymery jsou polymerní materiály, které na malé vnější podněty očividně mění své fyzikální nebo chemické vlastnosti. Inteligentní polymery lze klasifikovat podle podnětů, na které reagují, jako jsou změny teploty, mechanické namáhání, ozáření světlem, aplikace ultrazvuku, aplikace vnějšího magnetického či elektrického pole, změny pH, iontové síly, přidání chemických činidel a přítomnost biomolekul či bioaktivních molekul. Na podněty reagující systémy syntetických polymerů přitahují značnou pozornost díky širokému spektru aplikací, jako jsou systémy pro řízené dodávání a uvolňování léčiv, diagnostiku, tkáňové inženýrství a "inteligentní" optické systémy, stejně jako biosenzory, mikroelektromechanické systémy, nátěry a textilie. V této disertaci byly studovány polymerní systémy reagující na teplotu, pH a reaktivní kyslík (ROS). V případě termoresponsivních polymerů, kdy jsou v dobrém rozpouštědle polymerní řetězce molekulárně rozpuštěny, se změnami teploty (zvýšení nebo pokles) dochází k teplotou- indukované fázové separaci a tvorbě globulárních nanočástic. Polymery reagující na pH mění své vlastnosti, jako jsou rozpustnost, objem (gely), konformace řetězce, jakož i vazby, které se mohou při změnách pH štěpit. ROS-responzivita může vést ke...
|
host ::
RSS.