|
|
Fyziologické a patofyziologické aspekty metabolismu sulfanu u člověka
Neminářová, Kristýna ; Kožich, Viktor (vedoucí práce) ; Tolde, Ondřej (oponent)
Sulfan (H2S) je po dlouhou dobu známý jako toxický plyn a v poslední době se prokázala jeho funkce jako významné signální molekuly. Sulfan vzniká v malých koncentracích v organismu a fyziologicky působí v celé řadě tkání např. mozku, cévách, plicích. V organismu je tvořen enzymaticky v největší míře z L- cysteinu, přičemž nejvíce se na jeho vzniku podílí enzym cystathionin β-syntáza (CBS, EC 4.2.1.22, L-serin hydro-lyáza) vyskytující se zejména v mozku a cystathionin γ-lyáza (CSE, EC 4.4.1.1, L-cystathionin cystein-lyáza) generující sulfan především v tenkém střevě, portální žíle a hrudní aortě. Sulfan působí jako vazorelaxační faktor v cévách a tím snižuje krevní tlak, v mozku se podílí na přenosu nervového vzruchu. Kromě účinků v mozku a cévách hraje roli v procesech spojených se zánětem nebo v procesu přenosu bolesti. Mezi mechanismy působení sulfanu patří zejména aktivace KATP kanálů (cévy, zažívací trakt, zánět), aktivace NMDA receptorů (mozek), redukce molekul způsobujících oxidativní stres (plíce, mozek), či regulace vstupu vápenatých iontů do buněk (retina). Na základě těchto zjištění je patrné, že by ovlivnění metabolismu sulfanu mohlo mít vysoký terapeutický potenciál, jak u srdečních nemocí, tak u zánětlivých procesů. V popředí zájmu je v současnosti objasnění úlohy sulfanu ve zdraví a...
|
|
|
Molecular mechanisms in homocystinuria: spatial arrangement of human cystathionine β-synthase
Hnízda, Aleš ; Kožich, Viktor (vedoucí práce) ; Holada, Karel (oponent) ; Jiráček, Jiří (oponent)
Chybné sbalování proteinů je považováno za hlavní patogenetický mechanismus homocystinurie z deficitu cystathionin beta-synthasy (CBS). Cílem této práce bylo studium molekulových mechanismů, které vedou k chybnému sbalování mutantních forem CBS. V první části práce jsme studovali prostorové uspořádání normální lidské CBS. Pomocí diferenčního kovalentního značení povrchově dostupných aminokyselinových zbytků jsme identifikovali kontaktní plochu mezi katalytickým jádrem a regulační doménou v lidské CBS a následně jsme navrhli strukturní model plnodélkového enzymu. V další části práce jsme studovali evoluční divergenci proteinových struktur CBS. Provedli jsme fylogenetickou analýzu, která odhalila unikátní uspořádání pro CBS z třídy nematod; doménová architektura CBS z Caenorhabditis elegans byla podrobně studována experimentálně. Nakonec jsme studovali konformační vlastnosti vybraných mutantních forem lidské CBS, které měly do různé míry narušenou tvorbu tetrameru a sníženou enzymovou aktivitu. Pomocí proteolytických technik s využitím thermolysinu jsme analyzovali devět mutantních forem, které byly exprimovány v E.coli. Zjistili jsme, že rozbalení struktury je běžným jevem při chybném sbalování mutantních CBS. Důležitost rozbalení proteinů pro patogenesi deficitu CBS byla dále prokázána pomocí...
|
|
|
Regulatory mechanisms of ornithin transcarbamylase and beta-glucocerebrosidase gene expression and their relevance to diagnostics
Lukšan, Ondřej ; Jirsa, Milan (vedoucí práce) ; Kožich, Viktor (oponent) ; Kříž, Vítězslav (oponent)
4 Abstrakt Konečná diagnóza d dičných metabolických poruch je obvykle určena na základ vyšet ení enzymové aktivity (což je mnohdy komplikované) a/nebo za pomoci molekulárn genetického vyšet ení. Výsledky standardní mutační analýzy však mohou být n kdy zavád jící, zejména v p ípad rozsáhlých reorganizací na úrovni chromozomu či u mutací v regulačních oblastech. P edkládaná práce je zam ena na charakterizaci komplexních mutací v genu pro ornitin transkarbamylázu (OTC), studium regulačních oblastí OTC a genu pro β-galaktozidázu (GBA). V rámci studie provedené na souboru čítajícím 37 pacient s kongenitální hyperamonémií II. typu (OTCD) bylo identifikováno a charakterizováno 14 nových mutací včetn t í rozsáhlých delecí. Byl zaznamenán i p ípad symptomatické heterozygotky pro hypomorfní mutaci p.R129H, u níž byl fenotyp OTCD z ejm podmín n posunem v X-inaktivaci ve prosp ch mutované alely. Nález byl podložen sledováním nevýhodné X-inaktivace ve t ech r zných periferních tkáních. Za účelem prov ení patogenity promotorové variace c.-366A>G v OTC nalezené v jedné rodin s mírným fenotypem OTCD byly identifikovány t i alternativní počátky transkripce (PT) a vymezen promotor lidského OTC. Transkripční aktivita promotoru, stejn tak jako aktivita nov nalezeného distálního enhanceru, byla ov ena funkční esejí. Výsledky...
|
|
| |
|
|
Fyziologické a patofyziologické aspekty metabolismu sulfanu u člověka
Neminářová, Kristýna ; Kožich, Viktor (vedoucí práce) ; Tolde, Ondřej (oponent)
Sulfan (H2S) je po dlouhou dobu známý jako toxický plyn a v poslední době se prokázala jeho funkce jako významné signální molekuly. Sulfan vzniká v malých koncentracích v organismu a fyziologicky působí v celé řadě tkání např. mozku, cévách, plicích. V organismu je tvořen enzymaticky v největší míře z L- cysteinu, přičemž nejvíce se na jeho vzniku podílí enzym cystathionin β-syntáza (CBS, EC 4.2.1.22, L-serin hydro-lyáza) vyskytující se zejména v mozku a cystathionin γ-lyáza (CSE, EC 4.4.1.1, L-cystathionin cystein-lyáza) generující sulfan především v tenkém střevě, portální žíle a hrudní aortě. Sulfan působí jako vazorelaxační faktor v cévách a tím snižuje krevní tlak, v mozku se podílí na přenosu nervového vzruchu. Kromě účinků v mozku a cévách hraje roli v procesech spojených se zánětem nebo v procesu přenosu bolesti. Mezi mechanismy působení sulfanu patří zejména aktivace KATP kanálů (cévy, zažívací trakt, zánět), aktivace NMDA receptorů (mozek), redukce molekul způsobujících oxidativní stres (plíce, mozek), či regulace vstupu vápenatých iontů do buněk (retina). Na základě těchto zjištění je patrné, že by ovlivnění metabolismu sulfanu mohlo mít vysoký terapeutický potenciál, jak u srdečních nemocí, tak u zánětlivých procesů. V popředí zájmu je v současnosti objasnění úlohy sulfanu ve zdraví a...
|
|
|
Regulatory mechanisms of ornithin transcarbamylase and beta-glucocerebrosidase gene expression and their relevance to diagnostics
Lukšan, Ondřej ; Jirsa, Milan (vedoucí práce) ; Kožich, Viktor (oponent) ; Kříž, Vítězslav (oponent)
4 Abstrakt Konečná diagnóza d dičných metabolických poruch je obvykle určena na základ vyšet ení enzymové aktivity (což je mnohdy komplikované) a/nebo za pomoci molekulárn genetického vyšet ení. Výsledky standardní mutační analýzy však mohou být n kdy zavád jící, zejména v p ípad rozsáhlých reorganizací na úrovni chromozomu či u mutací v regulačních oblastech. P edkládaná práce je zam ena na charakterizaci komplexních mutací v genu pro ornitin transkarbamylázu (OTC), studium regulačních oblastí OTC a genu pro β-galaktozidázu (GBA). V rámci studie provedené na souboru čítajícím 37 pacient s kongenitální hyperamonémií II. typu (OTCD) bylo identifikováno a charakterizováno 14 nových mutací včetn t í rozsáhlých delecí. Byl zaznamenán i p ípad symptomatické heterozygotky pro hypomorfní mutaci p.R129H, u níž byl fenotyp OTCD z ejm podmín n posunem v X-inaktivaci ve prosp ch mutované alely. Nález byl podložen sledováním nevýhodné X-inaktivace ve t ech r zných periferních tkáních. Za účelem prov ení patogenity promotorové variace c.-366A>G v OTC nalezené v jedné rodin s mírným fenotypem OTCD byly identifikovány t i alternativní počátky transkripce (PT) a vymezen promotor lidského OTC. Transkripční aktivita promotoru, stejn tak jako aktivita nov nalezeného distálního enhanceru, byla ov ena funkční esejí. Výsledky...
|
|
|
The metabolism and signaling of hydrogen sulfide: the role of CBS-related proteins in Caenorhabditis elegans
Vozdek, Roman ; Kožich, Viktor (vedoucí práce) ; Macůrková, Marie (oponent) ; Jiráček, Jiří (oponent)
Sirovodík (H2S) je toxický plyn, který ve vysokých koncentracích způsobuje respirační selhání a smrt organismu, zatímco v nízkých koncentracích hraje roli jako vasodilatátor, neuromodulátor, a chrání buňky a tkáně před reperfuzním poškozením, hypoxií, hyperglykémií či dysfunkcí endotelu. Ke studiu fyziologie a signalizace H2S je využíváno hned několik modelových organismů. Hlístice Caenorhabditis elegans je pozoruhodným modelem ke studiu fyziologie, vývojové biologie, a v neposlední řadě i signalizace H2S, nicméně metabolismus sirovodíku v tomto organismu není známý. Cystathionin-beta-synthasa (CBS) je jedním ze tří enzymů produkujících H2S u živočichů. Zajímavé je, že u C. elegans je postulováno hned šest genů kódující homologní proteiny k CBS (cbs-1, cbs-2, cysl-1, cysl -2, cysl -3 a cysl -4). Cílem této práce bylo zjistit funkci těchto genů v metabolismu a signalizaci H2S u C. elegans. Nejprve jsme identifikovali cbs-1 jako gen kódující CBS; rekombinantní purifikovaný protein CBS-1 vykázal CBS aktivitu a RNA interference cbs-1 vedla ke snížené CBS aktivitě a zvýšené hladině homocysteinu v červích homogenátech, což rekapituluje deficit CBS u savců. Je zajímavé, že hlístí a savčí CBS mají odlišnou doménovou architekturu a tedy i posttranslační regulaci. Dále jsme zjistili, že ostatní proteiny...
|
|
|
Studium fyziologických funkcí betain homocystein S-methyltransferasy a betain homosystein S-methyltransferasy 2
Mládková, Jana ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent) ; Kožich, Viktor (oponent)
Betain homocystein S-methyltransferasa (BHMT) a betain homocystein S-methyltransferasa 2 (BHMT-2) jsou dva savčí cytozolické metaloenzymy. Oba tyto enzymy se účastní metabolizmu homocysteinu (Hcy), konkrétně jeho remethylace, především v jaterních a také ledvinných buňkách. BHMT přenáší methylovou skupinu z betainu na L-Hcy za vzniku L-methioninu a dimethylglycinu (DMG). BHMT-2 přenáší methylovou skupinu z S-methylmethioninu (SMM) také na L-Hcy za vzniku dvou molekul L-methioninu. Poruchy v metabolizmu Hcy mohou vést k tzv. hyperhomocysteinemii nebo homocystinurii, které mohou mít souvislost s řadou patologických stavů. BHMT je již relativně dobře prozkoumaným enzymem. Je známa její krystalová struktura, reakční mechanizmus, připravena byla řada inhibitorů tohoto enzymu, které umožnily také in vivo studie, a nedávno se po dlouhé době podařilo vyvinout Bhmt-/- myší model. Výzkum BHMT-2 je oproti tomu teprve v začátcích a fyziologické funkce BHMT-2 zůstávají stále neznámé. Důvodem je velká nestabilita BHMT-2 a také absence selektivních inhibitorů. BHMT a BHMT-2 jsou velmi podobné enzymy, které mají 73% identitu v primární sekvenci. Výsledky této dizertační práce poskytují nové informace o vlastnostech a strukturních požadavcích aktivního centra BHMT. Tyto informace byly získány pomocí třiceti nově...
|
|
|
Molecular mechanisms in homocystinuria: spatial arrangement of human cystathionine β-synthase
Hnízda, Aleš ; Kožich, Viktor (vedoucí práce) ; Holada, Karel (oponent) ; Jiráček, Jiří (oponent)
Chybné sbalování proteinů je považováno za hlavní patogenetický mechanismus homocystinurie z deficitu cystathionin beta-synthasy (CBS). Cílem této práce bylo studium molekulových mechanismů, které vedou k chybnému sbalování mutantních forem CBS. V první části práce jsme studovali prostorové uspořádání normální lidské CBS. Pomocí diferenčního kovalentního značení povrchově dostupných aminokyselinových zbytků jsme identifikovali kontaktní plochu mezi katalytickým jádrem a regulační doménou v lidské CBS a následně jsme navrhli strukturní model plnodélkového enzymu. V další části práce jsme studovali evoluční divergenci proteinových struktur CBS. Provedli jsme fylogenetickou analýzu, která odhalila unikátní uspořádání pro CBS z třídy nematod; doménová architektura CBS z Caenorhabditis elegans byla podrobně studována experimentálně. Nakonec jsme studovali konformační vlastnosti vybraných mutantních forem lidské CBS, které měly do různé míry narušenou tvorbu tetrameru a sníženou enzymovou aktivitu. Pomocí proteolytických technik s využitím thermolysinu jsme analyzovali devět mutantních forem, které byly exprimovány v E.coli. Zjistili jsme, že rozbalení struktury je běžným jevem při chybném sbalování mutantních CBS. Důležitost rozbalení proteinů pro patogenesi deficitu CBS byla dále prokázána pomocí...
|
|
| |
host ::
RSS.