|
|
Studium extracelulární části myšího receptoru Nkr-p1b přirozených zabíječských buněk pomocí NMR
Skála, Kristián ; Chmelík, Josef (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
Protein Nkr-p1b je povrchový receptor cytotoxických NK buněk, který zprostředkovává inhibiční signál vůči buňkám tělu vlastním. V rámci této práce byla pomocí rekombinantní exprese v buňkách E. coli připravena ligand vazebná doména myšího proteinového receptoru Nkr-p1b (mNkr-p1b LBD), která byla následně použita pro NMR strukturní analýzu. Pomocí třech různých metod (CD, PSIPRED a TALOS) bylo určeno zastoupení sekundárních struktur v molekule proteinu. Získané procentuální zastoupení sekundárních struktur přibližně odpovídá struktuře CTLD domény, která je důležitá pro vazbu ligandu, a tedy funkci receptoru Nkr-p1b. Daný protein se podařilo připravit ve formě vhodné pro NMR experimenty. Na základě dat získaných analýzou NMR spekter byl vytvořen předběžný model struktury proteinu mNkr-p1b LBD. Pro přesnější učení 3D struktury však ještě bude v dalších fázích potřeba vyhodnotit další NMR spektra, a upřesnit tak polohu jednotlivých atomů v molekule proteinu. Rozluštění struktury LBD domény proteinu mNkr-p1b by mohlo pomoci lépe pochopit komplexní mechanizmus aktivace NK buněčné cytotoxické aktivity, a tím přispět k jejímu řízenému využití jako terapeutika proti některým virovým a nádorovým onemocněním.
|
|
|
Strukturní studium potkaního NK buněčného receptoru NKR-P1B a jeho ligandu Clrb
Skořepa, Ondřej ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
NK buňky vykazují unikátní schopnost rozeznávat a způsobit smrt nádorových, či virem infikovaných buněk bez předchozí senzitizace antigenem. Jejich funkce je regulována vyváženými signály indukovanými aktivačními a inhibičními povrchovými receptory při interakci s ligandy cílové buňky. To může být ilustrováno na potkaním receptoru NKR-P1B a jeho ligandu Clrb, které hrají mimo jiné zásadní roli v odpovědi NK buněk na infekci potkaním cytomegalovirem (RCMV). Během infekce RCMV cílová buňka snižuje expresi ligandu Clrb a tím snižuje inhibiční signál přenášený skrze NKR-P1B do NK buňky, to v ideálním případě vede k aktivaci NK buňky a lyzi infikované buňky. Nicméně, RCMV obsahuje gen pro falešný povrchový receptor - RCTL, který napodobuje Clrb, a tak napomáhá úniku před imunitní odpovědí NK buněk. Zatímco tato úniková strategie byla zaznamenána v kmeni potkanů WAG, ukázalo se, že NKR-P1B homolog z potkaního kmene SD váže pouze Clrb a nerozeznává RCTL. Díky tomu je SD kmen méně citlivý k infekci RCMV. Tato práce si klade za cíl poodhalit molekulární základ NKR-P1B:Clrb receptor- ligandového rozeznávání, přičemž vychází z našich dřívějších úspěšných výsledků získaných pro lidský NKR-P1:LLT1 receptor-ligandový pár. Ukázalo se, že pro následnou krystalizaci NK buněčných receptorů a jejich ligandů je...
|
|
|
Vliv progesteronu na maternální imunitní systém v těhotenství
Škvorová, Anna ; Koucký, Michal (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Těhotenství představuje velkou výzvu pro maternální imunitní systém. Z imunologického pohledu je plod semi-alogenním štěpem. Mechanismy umožňující imunologický paradox tolerance plodu stále nejsou dostatečně známy a vyžadují další výzkum. Komplikovaná síť imuno-endokrinních interakcí zajišťuje růst a vývoj plodu uvnitř matčiny dělohy. Nezastupitelnou úlohu v těhotenství hraje progesteron. Cílem této práce je shrnout dosavadní poznatky o působení progesteronu na imunitní systém v těhotenství a jeho mechanismech. Progesteron může působit na cílové buňky pomocí klasických jaderných progesteronových receptorů, které fungují jako transkripční faktory, nebo různými jinými způsoby, včetně negenomové rychlé signalizace. Progesteron vytváří podmínky pro úspěšné početí a těhotenství, mění množství, lokalizaci a vlastnosti imunitních buněk a produkci cytokinů. Například redukuje antigen-prezentující kapacitu dendritických buněk, monocytů a makrofágů, potlačuje cytotoxicitu NK buněk, podporuje proliferaci děložních NK a dendritických buněk, ovlivňuje B lymfocyty a indukuje vznik T regulačních lymfocytů a jejich přísun na fetomaternální rozhraní. Široká škála imunomodulačních vlastností progesteronu zasluhuje další výzkum. Jejich lepší pochopení může vydláždit cestu k rozvoji vhodné diagnostiky a léčby...
|
|
|
Příprava rozpustné formy myšího NKR-P1A proteinu pro NMR analýzu
Skála, Kristián ; Chmelík, Josef (vedoucí práce) ; Adámková, Lyubina (oponent)
Přirození zabíječi (NK buňky) patří mezi lymfocyty a funkčně jsou definováni jako buňky schopné cytotoxicky usmrtit cílové buňky bez předchozí senzibilizace. Jednou z rodin povrchových receptorů NK buněk je rodina NKR-P1. Členové této rodiny patří mezi receptory C-lektinového typu, přičemž některé plní funkci aktivační a jiné inhibiční. Rozpustná forma myšího proteinu Nkr-p1a je izoformou aktivačního receptoru Nkr-p1a. V jeho aminokyselinové sekvenci chybí významná část transmembránové domény, proto je vysoká pravděpodobnost jeho výskytu v cytoplazmě. Tato práce se zaměřuje na optimalizaci podmínek produkce rozpustné formy myšího Nkr-p1a proteinu v bakteriálním kmeni E. coli BL21(DE3) Gold, jeho izolaci ve formě inkluzních tělísek a purifikaci pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Byla optimalizována koncentrace induktoru exprese, doba a teplota produkce. Cílem optimalizace pracovního postupu je jeho využití pro přípravu izotopově značeného proteinu pro strukturní studium metodou nukleární magnetické rezonance.
|
|
|
Produkce a purifikace rekombinantního receptoru Clrb
Prokopová, Tereza ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Přirozeně cytotoxické buňky hrají zásadní roli v nespecifické imunitě. I bez antigenně specifických receptorů na svém povrchu jsou schopny výkonné obranyschopnosti. Rozeznávají jak "cizí", tak tělu vlastní molekuly, respektive absenci tělu vlastních molekul, konkrétně MHC glykoproteinů I. třídy, na površích cílových buněk. Jsou schopny rozeznat virem napadené a nádorové buňky v organismu. Pokud dojde ke kontaktu s buňkou nesoucí abnormálně málo MHC glykoproteinů I. třídy, je to pro přirozenou zabíječskou buňku ("natural killer cell", NKC) signál, že tato buňka je například napadená virem. I bez předchozí stimulace, proliferace a diferenciace NK buňka spouští apoptózu cílové buňky. Je také schopna spustit zánětlivé reakce produkcí chemokinů a cytokinů. Výsledná reakce je vždy souhrou aktivačních a inhibičních signálů, které buňka přijímá ze svého okolí. Nejnovější výzkumy ukazují, že cílená modulace NK buněk vede ke zmírnění komplikací při transplantaci kostní dřeně. Zároveň mají potenciál v imunoterapiích, např. při léčbě autoimunitních onemocnění. Z tohoto důvodu jsou NK buňky velmi studovanou skupinou buněk. Tato práce se zabývá produkcí Clrb ("C-type-lectin-related protein b"). Tento protein je ligandem pro inhibiční receptor potkaních NK buněk NKR-P1B. Pokud napadená buňka na svém povrchu...
|
|
|
NK cell involvement in the pathogenesis of autoimmune arthritis
Richter, Jan ; Fišerová, Anna (vedoucí práce) ; Hromadníková, Ilona (oponent) ; Turánek, Jaroslav (oponent)
Revmatoidní artritida, jakožto jedno z nejčetnějších autoimunitních onemocně- ní vůbec, představuje celosvětový problém. Navzdory častému výskytu této choroby nebyla její patogeneze dosud zcela objasněna. Revmatického procesu se účastní řada imunitních buněk od antigen-prezentujících buněk po T, B a NK buňky. V této práci jsme se zaměřili na NK buňky exprimující repertoár aktivačních a inhibičních recepto- rů, které ovlivňují jejich funkci ve zdraví i nemoci. Zaměřili jsme se na analýzu funkce NK buněk a popsali možnosti její modulace revmatickými autoantigeny a multivalent- ními glykodendrimery nesoucími 4 (GN4C) nebo 8 (GN8P) N-acetyl-glukosaminových skupin. Jejich efekt na NK buňky a glykosylační dráhy byl studován in vitro. In vivo stu- die provedená na kolagenem-indukované artritidě (CIA) - myším modelu RA - byla provedena ke zjištění efektu těchto látek na rozvoj klinických příznaků choroby a vy- brané imunitní parametry. Srovnání NK-buněčné cytotoxicity u pacientů s RA, dalšími zánětlivými one- mocněními a u zdravých dárců prokázalo její poškození především právě u pacientů s RA. NK buňky periferní krve reagovaly na glykokonjugát GN8P inhibicí své efektoro- vé funkce u vzorků s vysokou expresí CD161. Exprese mRNA pro glykosyltransferázu MGAT5 byla zvýšena v synoviocytech pacientů, ale ne v...
|
|
|
Příprava a studium lidského NK buněčného receptoru AICL
Nový, Jiří ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
Přirozené zabíječské buňky neboli NK buňky jsou nedílnou součástí přirozené imunity a plní funkci rozpoznání a usmrcení nádorových a virem infikovaných buněk. Jejich funkce je regulována signály produkovanými díky interakci inhibičních a stimulačních receptorů na svém povrchu se svými specifickými ligandy na povrchu cílové buňky. Aktivačním receptorem je také NK receptor NKp80, který tvoří velmi specifický komplex s buněčným receptorem AICL, přičemž oba tyto receptory spadají do rodiny receptorů podobným lektinům C-typu. Zvýšená exprese receptoru AICL je přednostně specifická pro nádorové buňky myeloidního charakteru. Tato diplomová práce popisuje produkci mutované formy AICL expresí v bakteriích Escherichia coli BL21 Gold (DE3) a následnou izolaci a in vitro renaturaci cílového proteinu. V předchozí studii bylo zjištěno, že lichý počet cysteinů v extracelulární lektinové doméně AICL způsobuje špatné sbalení proteinu. Záměnou lichého cysteinu za serin v poloze 87 bylo dosaženo zisku stabilní rozpustné formy AICL se sudým počtem cysteinů v konzervovaných pozicích, charakteristickým pro receptory C-lektinového typu. Správnost tvorby disulfidových můstků mezi cysteiny byla ověřena hmotnostní spektrometrií. Zisk značného množství proteinu umožnil nasazení krystalizačních pokusů v širokém spektru...
|
|
|
Lectin receptor-ligand interaction important in experimental tumor therapy
Grobárová, Valéria ; Černý, Jan (vedoucí práce) ; Filipp, Dominik (oponent) ; Krulová, Magdaléna (oponent)
Lektin-sacharidové interakce jsou zapojeny do mnoha biologických procesů, které jsou nezbytné pro přežití a správnou funkci mnohobuněčných organismů. Receptory podobné lektinům C-typu, které se nacházejí převážně na povrchu buněk vrozeného imunitního systému, rozpoznávají sacharidové struktury na mikrobech a také glykosylační vzorec na nádorových buňkách. Rodina receptorů NKR-P1 byla mezi prvními identifikovanými rodinami receptorů NK (natural killer-"přirozený zabíječ") buněk, nicméně ligandy pro některé členy zůstávají stále neznámé. V nedávné době byly po prošetření Etickou komisí Mikrobiologického ústavu AVČR v. v. i. a Univerzity Karlovy v Praze některé publikace popisující oligo- sacharidové struktury zakončené N-acetylglukosaminem jako možné ligandy pro NKR-P1 receptor doporučeny ke korekci/retrahování. Přezkoumání účinku glykodendrimerů, zejména vliv osmivětevných dendrimerů s N- acetyl-D-glukosaminem na polyamidoaminové kostře (GN8P), ukázalo většinou nepřímou roli NK buněk na modulaci imunitní odpovědi. Správně složené rozpustné rekombinantní potkaní NKR-P1A a myší NKR-P1C receptory nevážou neoglykoproteiny modifikované GlcNAc strukturami. Kromě toho byly pro vazbu sacharidů zjištěny nové cílové populace buněk (NKT buňky a makrofágy).
|
|
|
Studies on structure and biological functions of NKR-P1 receptors
Rozbeský, Daniel ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; Drbal, Karel (oponent)
Významnou součástí imunitního systému jsou NK buňky, které jsou schopny rozpoznávat a zabíjet některé nádorové a virem infikované buňky. Rozpoznávání abnormálních buněk je zprostředkováno sofistikovaným repertoárem aktivačních a inhibičních receptorů, které se nachází na povrchu NK buněk. Mezi nejznámější receptory patří rodina C-lektinových receptorů NKR-P1, o kterých se předpokládá, že jsou transmembránové proteiny II. typu vyskytující se na membráně v podobě disulfidicky vázaných homodimerů. Ačkoliv od jejich objevu uplynulo více než 20 let, jejich struktura a funkce je stále zahalená rouškou tajemství. Cílem disertační práce byl strukturní výzkum myších NKR-P1 receptorů za účelem poznat jejich funkce. V první části jsme vyvinuli metodu pro přípravu rekombinantních receptorů myší rodiny NKR-P1. Dále jsme se detailně zabývali receptorem NKR-P1A, jehož struktura byla vyřešena pomocí rentgenové strukturní analýzy s rozlišením 1,7 A. Unikátní vlastností struktury byla smyčka extendovaná z konzervované C-lektinové domény, která v krystalu interagovala se symetricky sdruženou molekulou. Konformace a flexibilita smyčky byla dále studována v roztoku pomocí vodík/deuteriové výměny a chemického síťování ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Jednotlivé analýzy potvrdily, že struktura NKR-P1A se v roztoku liší od...
|
|
|
NK cells and their receptors in immune regulation - possible targets for immunomodulation
Svoboda, Jan ; Fišerová, Anna (vedoucí práce) ; Pěknicová, Jana (oponent) ; Kročová, Zuzana (oponent)
(česky) Přirození zabíječi - buňky NK hrají důležitou roli v imunitním dohledu a regulaci jednak přímým cytotoxickým působením na infikované, transformované či jinak poškozené buňky, ale také produkcí cytokínů a chemokínů. Výsledná odpověď je dána převahou stimulačních nebo inhibičních signálů, přenášených širokou paletou membránových receptorů. Zabíječské s Ig- příbuzné molekuly KIR2DL4 a LILRB1, které rozpoznávají vlastní HLA-G molekuly během těhotenství stejně jako NKR-P1 receptory lišící se ve funkci a počtu izotypů jsou druhově závislé a redukované v průběhu fylogeneze, zatímco NKG2D, reagující na stresem indukované proteiny a adenozínové receptory (AR) potlačující zánětovou reakci, zůstávají evolučně konzervované. Cílem této práce bylo studium zapojení NK buněk a jejich receptorů v několika modelech imunitních poruch a u různých savčích druhů, za účelem získání nového náhledu na jejich funkci a možnost imunitní modulace. Ukázali jsme zde, že výběr druhu ve studiu ovlivnění NK buněčné funkce může být v některých případech kritický. Reakce na glykany, s využitím syntetického GlcNAc terminovaného glykomimetika GN8P, měla protichůdné účinky na NK buněčnou funkci u lidí a C57Bl/6 myší. U lidí byla snížena cytotoxická aktivita NK buněk s vysokou expresí NKR-P1A, zatímco u myší podání GN8P aktivalo...
|
host ::
RSS.