|
|
Chromatographic and mass-spectrometric analysis of lipids of vernix caseosa
Vavrušová, Aneta ; Cvačka, Josef (vedoucí práce) ; Kuda, Ondřej (oponent) ; Lísa, Miroslav (oponent)
Lipidomika je rychle se rozšiřující vědní obor, který zaznamenal v posledních letech vzrůstající pozornost a to zejména díky zvyšujícímu se vědomí o stěžejních rolích lipidů v biologických systémech. Hlavním cílem lipidomiky je systematické studium všech lipidů, zahrnuje popis jejich struktury, biologických funkcí v buňce a rovněž popis interakcí lipidů s dalšími molekulami. Spojení pokročilých analytických metod, jako je extrakce, chromatografie a hmotnostní spektrometrie, umožňuje efektivním způsobem studovat všechny aspekty lipidomiky. Předkládaná dizertační práce je komentovaným souborem ke dvěma publikovaným pracím a zabývá se využitím separačních technik a hmotnostní spektrometrie pro detekci a strukturní charakterizaci nových lipidových tříd v novorozeneckém mázku. V prvním případě bude popsáno použití techniky bezvodé kapalinové chromatografie na reverzní fázi ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií s chemickou ionizací za atmosférického tlaku (LC-APCI-MS2 ) pro strukturní charakterizaci cholesterol esterů ω-(O-acyl)-hydroxy mastných kyselin (Chl-ωOAHFAs) v novorozeneckém mázku. Pro účel izolace neutrálních Chl-ωOAHFAs byla vyvinuta metoda adsorpční tenkovrstvé chromatografie. Obecná struktura Chl-ωOAHFAs byla odvozena na základě analýzy jejich produktů transesterifikace a...
|
|
|
Hmotnostní spektrometrie s chemickou ionizací za atmosférického tlaku při nízkých průtocích: konstrukční řešení a využití
Strmeň, Timotej ; Cvačka, Josef (vedoucí práce) ; Sýkora, David (oponent) ; Polášek, Miroslav (oponent)
(CZ) V první části disertační práce se porovnávají ionizační reakce v APCI zdroji v přítomnosti, respektive nepřítomnosti krytu iontového zdroje (angl. "housing"). Pro účel studie těchto rozdílů se modifikoval komerční APCI zdroj tak, aby ho bylo možné použít jako otevřený i jako uzavřený zdroj. V pozitivním módu byla pozorovaná rozdílná ionizace u nepolárních sloučenin rozpuštěných v aprotických rozpouštědlech (toluenu, chloroformu a sírouhlíku). Zatímco v otevřeném zdroji převažovaly protonované molekuly nepolárních sloučenin, v uzavřeném zdroji byly většinou přítomny jejich radikálkationty. Zvýšená protonace v otevřeném zdroji byla způsobena pronikáním molekul vody do ionizačního prostoru. Voda kromě toho reagovala v otevřeném zdroji s alkyny za vzniku iontu [M + 19]+ . Fragmentační studie potvrdila, že se jednalo o 2-methylketony, které vznikaly adicí vody na alkyny dle Markovnikovho pravidla. Tím se potvrdil výskyt artefaktu v otevřeném zdroji, který může představovat komplikaci při kvalitativních analýzách. Dále bylo v otevřeném zdroji pozorováno potlačení tvorby iontu [M + 55]+ atmosférickým kyslíkem. V uzavřeném zdroji vznikal ion [M + 55]+ reakcí nenasycených sloučenin s acetonitrilem, přičemž jeho fragmentací bylo možné zjistit polohu dvojné vazby nenasycené sloučeniny. Z toho vyplývá,...
|
|
| |
|
|
Rekombinantní příprava DNA vazebné domény transkripčního faktoru TEAD4
Zákopčaník, Marek ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
5 Abstrakt Transkripční faktory TEAD hrají důležitou roli v řízení buněčného růstu a diferenciace. Jejich deregulace je spojována s řadou nádorových onemocnění. Proteiny TEAD rozpoznávají DNA pomocí vysoce konzervované DNA vazebné domény. Ta by mohla představovat slibný cíl terapeutického zásahu pro budoucí protinádorová léčiva. Cílem této diplomové práce byla produkce DNA vazebné domény transkripč- ního faktoru TEAD4 prodloužená o nestrukturovanou variabilní část spojující tuto doménu s transaktivační doménou. Jako purifikační kroky byla využita afinitní chromatografie a gelová permeační chromatografie. Následně byl produkovaný protein charakterizován pomocí hmotnostní spektrometrie. Konečným krokem bylo použití nativní elektroforézy k ověření schopnosti produkovaného proteinu vázat DNA. V průběhu purifikace byla pozorována fragmentace produkovaného pro- teinu od C-konce. Na základě analýzy spektra z hmotnostní spektrometrie byly popsány tři nejzastoupenější fragmenty produkovaného proteinu. První z forem (55 %) obsahovala aminokyseliny 30-131 proteinu TEAD4, druhá nejzastoupenější forma (18 %) obsahovala aminokyseliny 30-144 a třetí forma (16 %) obsahovala aminokyseliny 30-81. Na závěr byla u produkovaného proteinu potvrzena schop- nost vazby DNA, účinnost však byla nižší než očekávaná. Do budoucna je...
|
|
| |
|
|
Strukturní charakterizace interakce dvouvláknových DNA s transkripčním faktorem
Kadavá, Tereza ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Hubálek, Martin (oponent)
Transkripční faktory z rodiny proteinů TEAD jsou důležitou součástí mnohých eukaryotických regulačních procesů. Jsou součástí Hippo signální dráhy a podílí se na kontrole diferenciace buněk a apoptózy. Zájem o tyto proteiny též souvisí s jejich spojením s onkologickými onemocněními. DNA-vazebná doména TEAD transkripčních faktorů interaguje s M-CAT elementy dvouvláknové DNA, kterými jsou i sekvence dsDNA z exonu a enhanceru genu C-MYC, jejichž interakce s DNA-vazebnou doménou proteinů TEAD byla v této práci studována především iontovou mobilitou ve spojení s hmotnostní spektrometrií za použití nativní ionizace nanoelektrosprejem. Studiu proteinu TEAD1-DBD a jeho dsDNA komplexů předcházela produkce DNA-vazebné domény TEAD1 dle již optimalizovaného protokolu. TEAD1-DBD a jeho komplexy byly dále studovány pomocí kolizně indukované aktivace a zahřívání sprejovaného roztoku při použití nativní hmotnostní spektrometrie ve spojení s iontovou mobilitou. Při kolizní aktivaci bylo pozorováno kolizně indukované rozbalování proteinu i obou jeho komplexů s DNA. Při zahřívání sprejovaného roztoku bylo sledováno tavení dsDNA i komplexů a z naměřených hodnot byly určeny teploty tavení jednotlivých vzorků. Pomocí kalibrace iontové mobility s putující vlnou byly určeny kolizní průřezy jednotlivých molekul.
|
|
|
Studium využití derivatizačních reakcí pro ESI-MS analýzu obtížně ionizovatelných aryl chlorokomplexů rhenia
Vlk, Mikuláš ; Štícha, Martin (vedoucí práce) ; Kozlík, Petr (oponent)
Hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem je metoda vhodná pro strukturní analýzu koordinačních sloučenin s výbornou citlivostí a selektivitou. Některé komplexní sloučeniny však nejsou pomocí měkkých ionizačních technik přímo ionizovatelné. Tato diplomová práce se zabývá zkoumáním derivatizační reakce obtížně ionizovatelných komplexů komplexy rhenia s 1,2-dihydroxybenzem a 2,3-dihydroxytoluenem a strukturní analýzou produktů. Struktura a fragmentační mechanismy připravených derivátů byly zkoumány pomocí kolizně indukované disociace (CID). Teorie funkcionálu hustoty (DFT) byla použita pro predikci štěpených vazeb při fragmentaci na základě prodloužení vazeb během ionizace a pro popis struktury připravených komplexů.
|
|
|
Kvantifikace prokalcitoninu v lidském séru pomocí afinitních nosičů a hmotnostní spektrometrie
Dvořák, Josef ; Pompach, Petr (vedoucí práce) ; Kozlík, Petr (oponent)
Sepse je celosvětově rozsáhlé akutní onemocnění vyvolané nepřiměřenou reakcí imunitního systému na přítomnost patogenu v těle pacienta. Rychlá a správná diagnostika sepse umožňuje lékařům nasadit vhodnou léčbu, na kreré závisí pacientův život. Jako její specifický ukazatel se v klinické diagnostice používá protein prokalcitonin (PCT). Koncentrace PCT v krevním oběhu se při sepsi zvýší až tisícinásobně během krátkého časového úseku. Míra závažnosti sepse koreluje se zvyšující se koncentrací PCT. Všechny metody detekce prokalcitoninu v klinických laboratořích vycházejí z měření interakce PCT s protilátkou. Koncentrace prokalcitoninu je následně stanovena metodou kalibrační křivky. U metod využívaných v klinické praxi může dojít k nespecifickým interakcím použité protilátky s biomolekulami přítomnými ve vzorku. Nespecifické interakce mohou zkreslovat laboratorní výsledky. Další nevýhodou je potřeba specializovaných přístrojů pro detekci prokalcitoninu. Díky svým vlastnostem by mohla hmotnostní spektrometrie představovat vhodnou alternativní nebo doplňkovou metodu při kvantifikaci PCT. Cílem této diplomové práce bylo in situ nabohacení PCT na povrchově upravených afinitních nosičích s imobilizovanou protilátkou, které jsou kompatibilní s hmotnostní spektrometrií s laserovou ionizací/desorpcí za...
|
|
|
The novel combinations of experimental approaches: mass spectrometry (MS) and photo-induced surface labelling, electron release (PIER), or cross-linking (PIXL)
Tuzhilkin, Roman ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
V živých organismech probíhá každým okamžikem nespočet dějů s účastí přenosu/transportu elektronu (ET). Proto jejich studium je důležitým cílem moderní strukturně-funkční proteomiky. Pro řadu experimentů byl a je používán modelový protein azurin z P. aeruginosa. Tento modrý protein obsahující centrální atom mědi má charakteristické absorpční maximum při 630 nm v redoxním stavu Cu(II). Během jeho oxidace na Cu(I) dochází k poklesu hodnoty absorbance při 630 nm (A630) a tak lze UV-Vis spektra použít pro sledování průběhu jeho ET reakcí. Naším cílem bylo vložit světlem aktivovatelný strukturní analog kanonické aminokyseliny Met - L-2-amino-5,5-azihexanovou kyselinu (foto-Met) - do sekvence azurinu a využít vzniklý proteinový produkt pro studium oligomerizace azurinu v roztoku pomocí techniky světlem iniciovaného síťování (PIXL). Použitím optimalizovaných protokolů pro rekombinantní expresi v E. coli B834 jsme vložili foto-Met do přirozeného azurinu a konstruktu Az2W, ve kterém jsou přítomny dva blízké Trp, u kterých byla potvrzena role při elektronovém přeskoku ("hopping") napříč protein-proteinovým rozhraním. Míra inkorporace foto-Met do sekvence proteinů byla určena pomocí MALDI-TOF MS po separaci proteinů na SDS-PAGE a štěpení proteasou v gelu. Pomocí metody PIXL byl studován vliv rostoucí celkové...
|
|
|
Využití radikálového značení proteinů pomocí Togniho činidel ve strukturní biologii
Fojtík, Lukáš ; Kukačka, Zdeněk (vedoucí práce) ; Kolenko, Petr (oponent)
Metody strukturní proteomiky, mezi které se řadí iontová mobilita, chemické zesítění či kovalentní značení, lze zařadit mezi významné metody studia struktury biomolekul. Tyto metody v posledních dekádách významně přispěly k rozšíření našich znalostí o funkci, dynamice a molekulárních interakcích biomolekul a napomohly tak k pochopení důležitých biologických procesů v buňce. My jsme se rozhodli toto portfolio metod dále rozšířit, a to o přístup využívající fluoralkylové radikály generované Togniho činidly bez nutnosti použít laser. Jako modelové biomolekuly byly zvoleny proteinogenní aminokyseliny, proteiny ubiquitin, a apo- a holoformy myoglobinu. Radikály byly indukovány kyselinou askorbovou a terminovány nadbytkem tryptofanu. Analýza produktů radikálového značení byla prováděna hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením. V případě "Top down" analýzy byly testovány fragmentační techniky ETD, ECD-CID a v případě "Bottom up" byly proteiny štěpeny trypsinem a separovány na koloně s obrácenou fází spojenou s hmotnostním spektrometrem. V případě značení aminokyselin byly označeny všechny aromatické aminokyseliny a cystein. Následné mapování přístupnosti proteinového povrchu k rozpouštědlu fluoralkylovým radikálům přineslo strukturní informace, které jsou ve shodě se známou prostorovou strukturou...
|
host ::
RSS.