|
|
Structural studies of metal-dependent hydrolases: Histone Deacetylase 6 and Glutamate Carboxypeptidase II
Shukla, Shivam ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Stříšovský, Kvido (oponent) ; Kolenko, Petr (oponent)
Hydrolasy závislé na zinku patří do třídy metaloenzymů, které obsahují zinečnaté kationty katalyzující hydrolytické reakce. Strukturní studie těchto enzymů jsou prováděny za účelem získání detailních informací o povaze jejich trojrozměrné struktury, organizaci domén a štěpení jejich přirozených substrátů. Tato práce popisuje strukturní charakteristiku dvou různých metalohydrolas 1) lidské histondeacetylasy 6 (HDAC6) a 2) glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) s využitím odlišné sady biofyzikálních technik. HDAC6 je strukturně unikátní vícedoménový enzym složený z nestrukturovaných a globulárních domén. Reguluje množství buněčných procesů odštěpováním acetylové skupiny z postranních řetězců lysinů vyskytujících se v cílových proteinech. Je známo, že HDAC6 deacetyluje substráty odlišné od histonů jako je tubulin, Hsp90, cortactin a peroxiredoxiny. Vzhledem k jeho strukturní komplexnosti jsou dostupné strukturní informace o HDAC6 omezeny pouze na jeho globulární domény. V této studii byl použit komplexní metodický přístup založený na integraci experimentálních dat získaných několika ortogonálními biofyzikálními technikami, který umožnil tvorbu strukturního modelu HDAC6 v roztoku. Získaný model ukazuje, že díky svým nestrukturovaným oblastem HDAC6 může zaujímat více konformací a v roztoku se pravděpodobně...
|
|
|
Structure-assisted design of inhibitors targeting medicinally relevant enzymes
Djukic, Stefan ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Kutá-Smatanová, Ivana (oponent) ; Kolenko, Petr (oponent)
Racionální návrh léčiv je moderní efektivní přístup, využívající detailní znalosti trojrozměrné struktury k návrhu a optimalizaci nových inhibitorů cílících na klinicky relevantní enzymy. Metodou strukturní biologie, hojně využívanou v racionálním návrhu léčiv, je rentgenová krystalografie. Její silnou stránkou je schopnost poskytnout detailní obraz komplexu protein-inhibitor s rozlišením umožňujícím analýzu jednotlivých interakcí mezi inhibitorem a proteinem.PNP hraje klíčovou roli v metabolické dráze záchrany purinových nukleotidů, a je tak zajímavým terapeutickým cílem nejen pro léčbu T buněčných hematologických malignit, ale i parazitických infekcí. V našich studiích jsme se zaměřili na lidskou PNP a její ortholog v M. tuberculosis s cílem vyvinout nové inhibitory s vysokou specificitou a selektivitou pro každý z enzymů. Prezentované inhibitory patří do skupiny acyklických nukleosid fosfátů s 9-deazahypoxanthinovou nukleobází, obsahující tři funkční skupiny, které se vážou na všechna tři důležitá rozhraní aktivního místa: purin, fenyl a fosfonátovou skupinu. Nejlepší z inhibitorů dosáhly hodnot IC50 až 19 nM a 4 nM pro lidskou, respektive mykobakteriální PNP. Zavedení malých substituentů, jako například methoxy- nebo bromo- skupiny, na centrální fenylový kruh vedlo ke snížení afinity inhibitoru...
|
|
|
Mechanistic and structural studies of the cGAS-STING signalling pathway
Vavřina, Zdeněk ; Maloy Řezáčová, Pavlína (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent) ; Kolenko, Petr (oponent)
Signální dráha synthasy cyklického GMP-AMP (cGAS) a Stimulátoru genů pro interferony (STING) má zásadní roli ve vrozeném imunitním systému. Dráha je aktivována dvouvláknovou DNA (dsDNA) z patogenních organismů nebo cyklickými dinukleotidy, které slouží jako druzí poslové bakterií. Aktivace dráhy spouští expresi interferonů I. typu a prozánětlivých cytokinů. Disertační práce zkoumá vztah mezi cGAS a jeho substráty, resp. proteinem STING a jeho agonisty, z mechanistického a strukturního hlediska. Enzym cGAS je živočišný vnitrobuněčný senzor dsDNA, jež po navázání DNA syntetizuje cyklický dinukleotid 2′,3′-cGAMP aktivující adaptorový protein STING. Kromě 2′,3′-cGAMP může být STING aktivován také 3′,3′-cyklickými dinukleotidy, které slouží jako druzí poslové v bakteriích. Zkoumali jsme různé dinukleotidcyklasy, abychom lépe porozuměli jejich substrátové specifitě a mohli je využít pro přípravu nových cyklických dinukleotidů aktivujících STING. Jako nejvhodnější pro přípravu 2′,3′-cyklických dinukleotidů jsme identifikovali myší cGAS. Dále jsme identifikovali enzymy DncV z Vibrio cholerae a DisA z Bacillus thuringiensis jako vhodné pro syntézu 3',3'-cyklických dinukleotidů. Tyto enzymy se vyznačují vysokou katalytickou aktivitou, schopností využívat modifikované nukleosid-5'-trifosfáty jako substrát a...
|
|
|
Využití radikálového značení proteinů pomocí Togniho činidel ve strukturní biologii
Fojtík, Lukáš ; Kukačka, Zdeněk (vedoucí práce) ; Kolenko, Petr (oponent)
Metody strukturní proteomiky, mezi které se řadí iontová mobilita, chemické zesítění či kovalentní značení, lze zařadit mezi významné metody studia struktury biomolekul. Tyto metody v posledních dekádách významně přispěly k rozšíření našich znalostí o funkci, dynamice a molekulárních interakcích biomolekul a napomohly tak k pochopení důležitých biologických procesů v buňce. My jsme se rozhodli toto portfolio metod dále rozšířit, a to o přístup využívající fluoralkylové radikály generované Togniho činidly bez nutnosti použít laser. Jako modelové biomolekuly byly zvoleny proteinogenní aminokyseliny, proteiny ubiquitin, a apo- a holoformy myoglobinu. Radikály byly indukovány kyselinou askorbovou a terminovány nadbytkem tryptofanu. Analýza produktů radikálového značení byla prováděna hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením. V případě "Top down" analýzy byly testovány fragmentační techniky ETD, ECD-CID a v případě "Bottom up" byly proteiny štěpeny trypsinem a separovány na koloně s obrácenou fází spojenou s hmotnostním spektrometrem. V případě značení aminokyselin byly označeny všechny aromatické aminokyseliny a cystein. Následné mapování přístupnosti proteinového povrchu k rozpouštědlu fluoralkylovým radikálům přineslo strukturní informace, které jsou ve shodě se známou prostorovou strukturou...
|
|
|
Využití radikálového značení proteinů pomocí Togniho činidel ve strukturní biologii
Fojtík, Lukáš ; Kukačka, Zdeněk (vedoucí práce) ; Kolenko, Petr (oponent)
Metody strukturní proteomiky, mezi které se řadí iontová mobilita, chemické zesítění či kovalentní značení, lze zařadit mezi významné metody studia struktury biomolekul. Tyto metody v posledních dekádách významně přispěly k rozšíření našich znalostí o funkci, dynamice a molekulárních interakcích biomolekul a napomohly tak k pochopení důležitých biologických procesů v buňce. My jsme se rozhodli toto portfolio metod dále rozšířit, a to o přístup využívající fluoralkylové radikály generované Togniho činidly bez nutnosti použít laser. Jako modelové biomolekuly byly zvoleny proteinogenní aminokyseliny, proteiny ubiquitin, a apo- a holoformy myoglobinu. Radikály byly indukovány kyselinou askorbovou a terminovány nadbytkem tryptofanu. Analýza produktů radikálového značení byla prováděna hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením. V případě "Top down" analýzy byly testovány fragmentační techniky ETD, ECD-CID a v případě "Bottom up" byly proteiny štěpeny trypsinem a separovány na koloně s obrácenou fází spojenou s hmotnostním spektrometrem. V případě značení aminokyselin byly označeny všechny aromatické aminokyseliny a cystein. Následné mapování přístupnosti proteinového povrchu k rozpouštědlu fluoralkylovým radikálům přineslo strukturní informace, které jsou ve shodě se známou prostorovou strukturou...
|
|
|
Strukturní charakterizace intracelulární formy myšího Nkr-p1a proteinu.
Vaňková, Pavla ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Kolenko, Petr (oponent)
4 ABSTRAKT NK buňky jsou komponentou přirozeného imunitního systému, která je odvozena od lymfoidního progenitoru. Pomocí sofistikovaného receptorového repertoáru, jež exprimují na svém povrchu, se účastní obrany organismu proti patogenním, virem infikovaným nebo nádorovým buňkám. Současně produkují cytokiny, jejichž prostřednictvím pomáhají spoluutvářet i adaptivní imunitní odpověď. Tato práce je zaměřena na studium struktury rozpustné isoformy myšího receptoru mNkr-p1a, která byla v nedávné době na transkripční úrovni identifikována členem naší laboratoře a nese pracovní označení isoforma 2. Cílem práce bylo vyprodukovat protein mNkr-p1a iso2 v prokaryotickém expresním systému a provést jeho renaturaci a purifikaci in vitro. V další fázi byl získaný produkt analyzován metodami hmotnostní spektrometrie. Jí získané výsledky nás ovšem dovedly k určitým pochybnostem, zda náš protein v roztoku nabývá definovanou 3D strukturu a nejedná se pouze o artefakt. To bylo vyvráceno dalšími biofyzikálními metodami, nukleární magnetickou rezonancí a měřením cirkulárního dichroismu a dynamického rozptylu světla. Klíčová slova: NK buňky Receptor mNkr - p1a Krátká isoforma mNkr - p1a iso2 Alternativní sestřih Biosyntéza proteinů Produkce rekombinantních proteinů Purifikace proteinů Hmotnostní spektrometrie Disulfidové vazby...
|
host ::
RSS.