|
|
IN VITRO assays for investigating nucleic acid delivery.
Mihaličoková, Dajana ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Matoušková, Petra (oponent)
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra biochemických vied University of Vienna, Faculty center for Pharmacy, Department of Pharmaceutical Chemistry, Laboratory of MacroMolecular Cancer Therapeutics Kandidát: Dajana Mihaličoková Školiteľ (Univerzita Karlova): PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Školiteľ (University of Vienna): Univ.Prof. Dipl. Ing. Dr. Manfred Ogris Konzultant (University of Vienna): Dr. Haider Sami, Ph.D. Názov diplomovej práce: Hodnotenie transfekcie nukleových kyselin v in vitro podmienkach Kľúčové slová: transfekcia, úprava zostrihu, BCA test, polyplexy Jednou z najdôležitejších úloh súčasného biomedicínskeho výskumu je nájsť správnu cestu ako vyliečiť rakovinu, genetické choroby a iné choroby, ktoré sú stále nevyliečiteľné. Voči tomu, génová terapia je vynikajúca ako potencionálna liečba pomocou ktorej je možné dopraviť genetický materiál do bunky. Reportérové gény založené na transfekčnom procese môžu byť použité na štúdium génovej expresie. Transfekcia je sprostredkovaná pomocou vektorov, buď to virovými alebo nevirovými. Nevirové vektory ponúkajú mnoho výhod oproti virovým proťajškom v jednoduchšej príprave, sú pomerne lacné a najdôležitejšia je ich neimunogénnosť. Kationické polyméry založené na polyethylenimine tvoria komplexy s plazmidovou DNA...
|
|
|
Příprava transgenní kultury testikulárních kmenových buněk Xenopus tropicalis.
Vegrichtová, Markéta ; Tlapáková, Tereza (vedoucí práce) ; Drobná Krejčí, Eliška (oponent)
Testikulární kmenové buňky (TSCs) představují relativně dostupný zdroj potencionálně pluripotentních buněk, které jsou významné zejména pro své uplatnění v regenerativní medicíně. Pro studium migračního a diferenciačního potenciálu kmenových buněk je vhodným modelovým organismem Xenopus tropicalis. Tento obojživelník se vyznačuje vnějším oplozením a embryonálním vývojem značného množství zárodků v rámci jedné snůšky. Oocyty a embrya jsou dostatečně velká (kolem 1 mm) a tím i vhodná pro mikromanipulační zásahy. Laboratoř vývojové biologie PřF UK uspěla v založení smíšené buněčné kultury TSCs rostoucích na podkladové vrstvě pre-Sertoliho buněk. Tato kultura byla odvozena z varlat juvenilního samce X. tropicalis. V rámci studia jejich diferenciačního potenciálu bylo zjištěno, že rozhodujícím faktorem umožňujícím rychlou proliferaci kmenových buněk a jejich formování do charakteristických kolonií je leukemický inhibiční faktor (LIF). Tento protein je produkován oběma typy buněk přítomných v kultuře. Stejný pozitivní vliv na proliferační potenciál kmenových buněk má i myší LIF, což ukazuje na evoluční konzervovanost metabolických drah souvisejících s udržením kmenového charakteru. RT-PCR analýza dále odhalila téměř identický expresní profil u TSCs a podkladových pre-Sertoliho buněk. Na základě těchto...
|
|
|
Structure and dynamics of mouse C-type lectin-like receptors.
Wallenfels, Lucie
NK buňky jsou schopné rychle rozpoznat buňky infikované virem nebo také nádorové buňky a podílí se na regulaci odpovědí adaptivní imunity, proto představují velmi důležitou součást přirozené imunity. Funkce NK buněk jsou zajišťovány souhrou mezi jejich receptory, které dohromady vytváří složitý regulační systém. Vyřešení struktury jednotlivých receptorů by mohlo přispět k porozumění NK- buněčné biologie. Předkládaná dizertační práce je věnována řešení struktury inhibičního receptoru C-lektinového typu (CTLR) Nkrp1b, především je pak zaměřena na ty části jeho struktury (krček, smyčka a oligomerní stav), které mohou ovlivnit celkovou konformaci receptoru a také jeho interakce. Vazba receptoru Nkrp1b s jeho ligandem, proteinem Clr-b, je imunologicky významná, jelikož nezávisle reguluje aktivitu NK buněk a monitoruje změny, které nejsou detekovatelné cytotoxickými T lymfocyty. Aby mohly být studovány jednotlivé strukturní charakteristiky proteinu Nkrp1b, byly připraveny dvě jeho varianty: celá ektodoména a ligand-vazebná doména postrádající krček. S využitím několika různých technik hmotnostní spektrometrie v kombinaci s homologním modelováním a molekulární dynamikou byla navržena struktura receptoru Nkrp1b včetně jeho monomerního a dimerního uspořádání. Dále byl zkoumán oligomerizační stav receptoru...
|
|
|
Stimulace proliferace beta-buněk pankreatu pomocí syntetických modifikovaných mRNA kódující geny regulátorů buněčného cyklu
Ivanovská, Dana ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
je metabolické onemocnění, které se projevuje dlouhodobě zvýšenou krvi. Hyperglykémie je způsobena ztrátou pankreatických inzulín produkujících beta buněk. V případě diabetu mellitu II. typu bývá také spojena Z toho důvodu by náhrada nebo regenerace beta buněk pacientů. V současné době se vědecký výzkum zaměřuje stimulaci proliferace pankreatických beta buněk. potenciálně vhodné molekuly pro indukci proliferace beta buněk. Tyto proteiny řídí vstup buňky do buněčného cyklu. Cílem této bakalářské práce bylo ověřit možnost navození proliferace beta buněk prostřednictvím synteticky připravených mRNA cyklinů typu D syntetizovaných mRNA umožnuje krátkodobě zvýšenou expresi příslušných proteinů. Dále byly také využity mutované formy cyklinů D, které vyznačují vyšší stabilitou a tedy i delším poločasem života. Po transfekci sociovaných Langerhansových ostrůvků byla detekována přítomnost cyklinů typu D Cdk4/6 metodou nepřímé imunofluorescence. Současně byla také provedena metoda Western blotu s následnou imunodetekcí proteinů. Transfekce potkaních Langerhansových ostrůvků rů pro cykliny typu D s Cdk4/6 vedla ve všech případech k výrazné indukci proliferace potkaních beta buněk. Míra proliferace se pohybovala v rozmezí − kombinaci transfekovaných syntetických mRNA, kdežto u kontrolní netransfekovaných beta buněk byla...
|
|
|
Structure and dynamics of mouse C-type lectin-like receptors.
Wallenfels, Lucie
NK buňky jsou schopné rychle rozpoznat buňky infikované virem nebo také nádorové buňky a podílí se na regulaci odpovědí adaptivní imunity, proto představují velmi důležitou součást přirozené imunity. Funkce NK buněk jsou zajišťovány souhrou mezi jejich receptory, které dohromady vytváří složitý regulační systém. Vyřešení struktury jednotlivých receptorů by mohlo přispět k porozumění NK- buněčné biologie. Předkládaná dizertační práce je věnována řešení struktury inhibičního receptoru C-lektinového typu (CTLR) Nkrp1b, především je pak zaměřena na ty části jeho struktury (krček, smyčka a oligomerní stav), které mohou ovlivnit celkovou konformaci receptoru a také jeho interakce. Vazba receptoru Nkrp1b s jeho ligandem, proteinem Clr-b, je imunologicky významná, jelikož nezávisle reguluje aktivitu NK buněk a monitoruje změny, které nejsou detekovatelné cytotoxickými T lymfocyty. Aby mohly být studovány jednotlivé strukturní charakteristiky proteinu Nkrp1b, byly připraveny dvě jeho varianty: celá ektodoména a ligand-vazebná doména postrádající krček. S využitím několika různých technik hmotnostní spektrometrie v kombinaci s homologním modelováním a molekulární dynamikou byla navržena struktura receptoru Nkrp1b včetně jeho monomerního a dimerního uspořádání. Dále byl zkoumán oligomerizační stav receptoru...
|
|
|
Study of exosomes in polyomavirus infection
Hyka, Lukáš ; Šroller, Vojtěch (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
Exosomy jsou extracelulární váčky endosomálního původu. Původně se myslelo, že exosomy slouží pouze k vylučování buněčného odpadu, avšak se ukázalo, že slouží i ke komunikaci mezi buňkami a hrají roli i ve virových infekcích. Exosomy jsou využívány viry např. k přenosu virového proteinu či jejich RNA/DNA. Jedním z virů, u kterého není role exosomů při infekci objasněna je myší polyomavirus. Myší polyomavirus patří do čeledi Polyomaviridae, do které spadá i řada lidských virů, jako je např. JC virus či virus Merkelova karcinomu. Myší polyomavirus kóduje malý, velký a střední T antigen a tři kapsidové proteiny. O středním T antigenu je známo, že se váže na buněčné membrány. Vzhledem k tomu, že exosomy jsou membránově odvozené struktury, zaměřili jsme se možný přenos středního T antigenu. K tomuto cíli bylo potřeba nejdříve zvládnout metody izolace exosomů a jejich charakterizace. Exosomy byly izolovány pomocí ultracentrifugace a dále purifikovány na hustotním gradientu OptiPrep. Charakterizovány byly pomocí elektronové mikroskopie, přístroje NanoSight a proteinových exosomových markerů. Mezi tyto markery patří například Alix, či flotillin-1. Dále byly buňky transfekovány, aby exprimovali střední T antigen. Bylo ukázáno, že exosomy izolované z těchto buněk skutečně obsahovali střední T antigen....
|
|
|
Závislost velikosti proudu IKs kanálu srdce na stimulaci
Kachan, Ksenia ; Čmiel, Vratislav (oponent) ; Bébarová,, Markéta (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se věnuje studiu frekvenční závislosti velikosti proudu srdečním kanálem vedoucím pomalou složku opožděného draslíkového proudu z buňky (IKs). Tato vlastnost IKs kanálu má velký funkční význam. Za insuficience jiných repolarizačních proudů, ale i za zvýšené srdeční frekvence, zejména za zvýšeného tonu sympatiku, totiž IKs představuje tzv. repolarizační rezervu, čímž zabraňuje nadměrnému prodlužování repolarizace akčního napětí srdečních buněk. Struktura IKs kanálu je kódována geny KCNQ1 (-podjednotka formující pór kanálu) a KCNE1 (modulační -podjednotka). Mutace v těchto genech narušují fyziologickou funkci IKs kanálu a způsobují vznik dědičných arytmogenních syndromů, zejména syndromu dlouhého intervalu QT (LQTS). Mezi takové mutace patří i mutace c.926C>T (p.T309I) v genu KCNQ1, která vede u heterozygotních nosičů ke vzniku LQTS typu 1. Teoretická část diplomové práce poskytuje základní informace o IKs kanálu a patch clamp technice, které jsou nezbytné pro provedení části praktické. Experimentální část spočívá v kultivaci a přechodné transfekci buněčné linie CHO pro následné elektrofyziologické měření technikou whole-cell patch clamp s cílem zkoumání závislosti velikosti IKs na frekvenci stimulace, jak u kanálů bez mutace, tak u kanálů tvořených podjednotkami bez mutace i s mutací T309I.
|
|
|
IN VITRO assays for investigating nucleic acid delivery.
Mihaličoková, Dajana ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Matoušková, Petra (oponent)
Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra biochemických vied University of Vienna, Faculty center for Pharmacy, Department of Pharmaceutical Chemistry, Laboratory of MacroMolecular Cancer Therapeutics Kandidát: Dajana Mihaličoková Školiteľ (Univerzita Karlova): PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Školiteľ (University of Vienna): Univ.Prof. Dipl. Ing. Dr. Manfred Ogris Konzultant (University of Vienna): Dr. Haider Sami, Ph.D. Názov diplomovej práce: Hodnotenie transfekcie nukleových kyselin v in vitro podmienkach Kľúčové slová: transfekcia, úprava zostrihu, BCA test, polyplexy Jednou z najdôležitejších úloh súčasného biomedicínskeho výskumu je nájsť správnu cestu ako vyliečiť rakovinu, genetické choroby a iné choroby, ktoré sú stále nevyliečiteľné. Voči tomu, génová terapia je vynikajúca ako potencionálna liečba pomocou ktorej je možné dopraviť genetický materiál do bunky. Reportérové gény založené na transfekčnom procese môžu byť použité na štúdium génovej expresie. Transfekcia je sprostredkovaná pomocou vektorov, buď to virovými alebo nevirovými. Nevirové vektory ponúkajú mnoho výhod oproti virovým proťajškom v jednoduchšej príprave, sú pomerne lacné a najdôležitejšia je ich neimunogénnosť. Kationické polyméry založené na polyethylenimine tvoria komplexy s plazmidovou DNA...
|
|
|
Structure and dynamics of mouse C-type lectin-like receptors.
Wallenfels, Lucie ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Šebela, Marek (oponent)
NK buňky jsou schopné rychle rozpoznat buňky infikované virem nebo také nádorové buňky a podílí se na regulaci odpovědí adaptivní imunity, proto představují velmi důležitou součást přirozené imunity. Funkce NK buněk jsou zajišťovány souhrou mezi jejich receptory, které dohromady vytváří složitý regulační systém. Vyřešení struktury jednotlivých receptorů by mohlo přispět k porozumění NK- buněčné biologie. Předkládaná dizertační práce je věnována řešení struktury inhibičního receptoru C-lektinového typu (CTLR) Nkrp1b, především je pak zaměřena na ty části jeho struktury (krček, smyčka a oligomerní stav), které mohou ovlivnit celkovou konformaci receptoru a také jeho interakce. Vazba receptoru Nkrp1b s jeho ligandem, proteinem Clr-b, je imunologicky významná, jelikož nezávisle reguluje aktivitu NK buněk a monitoruje změny, které nejsou detekovatelné cytotoxickými T lymfocyty. Aby mohly být studovány jednotlivé strukturní charakteristiky proteinu Nkrp1b, byly připraveny dvě jeho varianty: celá ektodoména a ligand-vazebná doména postrádající krček. S využitím několika různých technik hmotnostní spektrometrie v kombinaci s homologním modelováním a molekulární dynamikou byla navržena struktura receptoru Nkrp1b včetně jeho monomerního a dimerního uspořádání. Dále byl zkoumán oligomerizační stav receptoru...
|
|
|
Transportní studie in vitro na 2D a 3D buněčné úrovni
Urbanová, Johana ; Ramos Mandíková, Jana (vedoucí práce) ; Smutná, Lucie (oponent)
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Studentka: Johana Urbanová Školitelka: PharmDr. Jana Ramos Mandíková, Ph.D. Název diplomové práce: Transportní studie na 2D a 3D buněčné úrovni. Trojrozměrné (3D) buněčné modely lépe napodobují buněčné podmínky in vivo než tradičně používané dvourozměrné (2D) buněčné modely. Transportéry pro organické anionty (OATs) a kationty (OCTs) hrají důležitou úlohu v ledvinné eliminaci léčiv a mají vliv na jejich farmakokinetické vlastnosti. Cílem práce bylo vytvořit 2D a 3D buněčný model z embryonálních ledvinných buněk HEK293, oba modely přechodně transfekovat transportérem hOAT1, transfekci optimalizovat a provést transportní inhibiční studie s vybranými NSAIDs (diklofenakem, ibuprofenem, indometacinem a naproxenem). 2D buněčný model jsme vytvořili ve 24jamkové destičce ve formě monovrstvy, jako 3D buněčný model jsme používali sféroidy, které jsme zhotovili na Petriho misce metodou visící kapky. Při transportních studiích jsme buňky inkubovali s radioaktivním substrátem OATs p-aminohippurovou kyselinou ([3 H]PAH) s nebo bez příslušného inhibitoru. Inhibiční vliv NSAIDs jsme porovnávali pomocí parametru IC50. 2D i 3D model z buněk HEK293 se nám povedlo vytvořit, ale následná transfekce byla úspěšná pouze v monovrstvě buněk. Funkčnost 3D modelu se pomocí transportní studie...
|
host ::
RSS.