|
|
Studium integrace DNA nádorových virů
Frčková, Tereza ; Saláková, Martina (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Většina lidí vnímá viry především jako původce nemocí jako je rýma, chřipka nebo COVID-19. Existují ale i viry, které mohou způsobovat nádorová onemocnění. Je známo hned několik způsobů, jak viry přispívají ke vzniku nádorů. V případě lidských papilomavirů a viru Merkelových buněk se jedná o expresi onkogenů kódovaných ve virových genomech. Kromě toho může docházet k integraci viru do hostitelského genomu, což může také přispět k rozvoji karcinogeneze. V této práci byla využita metoda detekce integrované papilomavirové sekvence pomocí polymerázové řetězové reakce (DIPS PCR) pro detekci integračního zlomu u lidských papilomavirů (HPV)-pozitivních buněčných linií odvozených od karcinomu cervixu, klinických vzorků karcinomu v oblasti hlavy a krku asociovaných s HPV a klinických vzorků karcinomu z Merkelových buněk. V případě karcinomu z Merkelových buněk byla metoda DIPS PCR provedena na vzorcích pocházejících z čerstvě zmražené tkáně a z řezů vzorků nádorů zalitých v parafínu. V případě tonsilárních nádorů asociovaných s HPV se jednalo pouze o čerstvě zmraženou tkáň. Pomocí metody DIPS PCR se podařilo detekovat integrační zlomy u vzorků z čerstvě zmražené tkáně i tkáně uchovávané v parafínu. U detekce integračních zlomů genomu HPV byla vyzkoušena nová sada primerů, která byla optimalizována na...
|
|
|
Adaptivní imunitní odpověď proti BK polyomavirové infekci
Rezlerová, Adéla ; Saláková, Martina (vedoucí práce) ; Roubalová, Kateřina (oponent)
BK polyomavirus je malý neobalený virus, který se vyskytuje ve velké části lidské populace. K infekci BKPyV dochází běžně už v raném dětství. Virus zakládá perzistentní infekci v renálních tubulárních buňkách a buňkách uroepitelu. U imunosuprimovaných jedinců, zejména po transplantaci ledvin či hematopoetických kmenových buněk, může reaktivace BKPyV vést k závažným komplikacím, jako je BKPyV asociovaná nefropatie (BKVAN), stenóza ureteru či hemoragická cystitida. Adaptivní imunita hraje zásadní roli při kontrole replikace a progrese infekce BKPyV. Důležitá je zejména T buněčná odpověď, kdy dochází k produkci CD4+ a CD8+ T- lymfocytů. Důležité jsou i B-lymfocyty, které produkují virus neutralizující protilátky. V současné době neexistují žádné účinné protivirové látky proti infekci BKPyV a snížení imunosuprese zůstává hlavní strategií k potlačení reaktivace. Zkoumání terapií založených na imunitním systému nabízí slibné možnosti účinné léčby komplikací spojených s polyomavirovou infekcí. Klíčová slova: BK polyomavirus, T buněčná odpověď, protilátky, hemoragická cystitida, BK polyomavirus-asociovaná nefropatie
|
|
|
Studium integrace DNA nádorových virů
Frčková, Tereza ; Saláková, Martina (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Většina lidí vnímá viry především jako původce nemocí jako je rýma, chřipka nebo COVID- 19. Existují ale i viry, které mohou způsobovat nádorová onemocnění. Existuje hned několik způsobů, jak viry přispívají ke vzniku nádorů. V případě lidských papilomavirů a viru Merkelových buněk se jedná o expresi onkogenů kódovaných ve virových genomech. Kromě toho může docházet k integraci viru do hostitelského genomu, což může také přispět k rozvoji karcinogeneze. V této práci byla využita metoda detekce integrované papilomavirové sekvence pomocí polymerázové řetězové reakce (DIPS PCR) pro detekci integračního zlomu u lidských papilomavirů (HPV)-pozitivních buněčných linií odvozených od karcinomu cervixu, klinických vzorků karcinomu v oblasti hlavy a krku asociovaných s HPV a klinických vzorků karcinomu z Merkelových buněk. V případě karcinomu z Merkelových buněk byla metoda DIPS PCR provedena na vzorcích pocházejících z čerstvě zmražené tkáně a z řezů vzorků nádorů zalitých v parafínu. V případě tonsilárních nádorů asociovaných s HPV se jednalo pouze o čerstvě zmraženou tkáň. Pomocí metody DIPS PCR se podařilo detekovat integrační zlomy u vzorků z čerstvě zmražené tkáně i tkáně uchovávané v parafínu. U detekce integračních zlomů genomu HPV byla vyzkoušena nová sada primerů, která byla optimalizována na...
|
|
|
Význam detekce volné cirkulující HPV DNA
Milt, Petr ; Saláková, Martina (vedoucí práce) ; Horníková, Lenka (oponent)
Lidské papilomaviry (HPV) jsou malé, neobalené DNA viry hojně se vyskytující v populaci. Přenáší se sexuálním nebo jiným blízkým kontaktem sliznic a kůže. Papilomaviry mohou vyvolávat vznik bradavic a lézí na kůži a sliznicích. Vysoce-rizikové typy HPV, především HPV 16 a 18, jsou navíc asociované s karcinomy dlaždicových buněk jako je karcinom děložního hrdla, orofaryngeální karcinom a karcinomy vulvy, anu, penisu a vaginy. Včasná detekce a správný odhad rizika rekurencí onemocnění jsou klíčové pro účinnou léčbu. Potenciál v nádorové diagnostice má volná cirkulující DNA, která se z buněk uvolňuje do tělních tekutin. Právě volná cirkulující HPV DNA v krvi pacientů s nádory asociovanými s HPV se v současnosti ukazuje jako slibný a velmi citlivý biomarker, vhodný především pro sledování účinnosti léčby a včasné odhalení rizika rekurence. Klíčová slova: HPV, karcinogeneze, cfDNA, cfHPV DNA, význam detekce, karcinom děložního hrdla, orofaryngeální karcinom
|
|
|
Virom dolních močových cest
Cirbusová, Adéla ; Saláková, Martina (vedoucí práce) ; Španielová, Hana (oponent)
Lidský močový trakt byl dlouhou dobu pokládán za sterilní prostředí. V posledních letech se však ukázalo, že je osídlen rozmanitou mikrobiální komunitou, jejíž součástí jsou i viry. O viromu moči je toho ale prozatím známo jen velmi málo. V této práci byl virom močového traktu charakterizován u tří jedinců ze vzorků moči pomocí metodiky sekvenování nové generace (NGS), jež byla nejprve pro tento účel optimalizována. Charakteristika viromu ze vzorků moči pomocí NGS se však ukázala být poměrně problematická, což bylo zapříčiněno především fragmentací virových genomů. I přes to se podařilo u všech tří jedinců identifikovat lidské endogenní retroviry a u dvou z nich také JC polyomavirus. Složka viromu moči tvořená lidskými DNA viry byla dále blíže prozkoumána pomocí kvantitativní PCR. Možný rozdíl v zastoupení a virové náloži lidských DNA virů byl pozorován u pacientů s karcinomem močového měchýře (mm) a bez karcinomu mm a také v závislosti na části močového traktu, ze které byl vzorek odebrán. Nejvíce zastoupené viry byly Torque Teno virus a JC polyomavirus. Torque Teno virus byl detekován u 75 % pacientů s karcinomem mm a 60 % pacientů bez karcinomu, JC polyomavirus u 43,8 % pacientů s karcinomem mm a 50 % pacientů bez karcinomu. U 25 % pacientů s karcinomem mm a 20 % pacientů bez karcinomu se dále...
|
|
|
Replication of Merkel cell polyomavirus (MCPyV) in human cell lines
Bučková, Alžbeta ; Saláková, Martina (vedoucí práce) ; Huerfano Meneses, Sandra (oponent)
Polyomavírus Merkelových buniek (MCPyV) je jediný ľudský polyomavírus označovaný ako pravdepodobne karcinogénny pre ľudí a je kauzálnym faktorom zriedkavého kožného karcinómu Merkelových buniek v približne 80% prípadov. Okrem kože bol tento vírus detegovaný v rôznych tkanivách po celom tele. Napriek tomu ideálny modelový systém stále chýba. V tejto diplomovej práci sú študované tri izoláty MCPyV získané zo zdravej ľudskej kože. Tieto izoláty majú mutácie - jeden má mutáciu v LT-kódujúcom géne, jeden má preskupený nekódujúci kontrolný región (NCCR) a jeden je zhodný s referenčným MCPyV izolátom R17b. Replikačné kapacity týchto troch izolátov boli študované so zameraním na vplyv preskupeného NCCR a mutácií na replikáciu MCPyV genómu in vitro po transfekcii. Výsledky ukazujú, že preskupenie v NCCR a mutácie v proteín-kódujúcich génoch majú vplyv na replikáciu MCPyV v 293 bunkách. Predbežné dáta ukazujú, že preskupenie v NCCR negatívne ovplyvňuje replikáciu MCPyV ale niektoré mutácie v proteín kódujúcich génoch môžu mať pozitívny vplyv na množstvo replikovanej DNA. Žiadny z izolátov sa nereplikoval v 293T bunkách. Ďalšia časť tejto práce je zameraná na replikáciu MCPyV izolátov v normálnych ľudských dermálnych fibroblastoch (NHDF), ktoré boli identifikované ako preferenčne infikované bunky MCPyV v...
|
|
|
Funkční analýza diferenciálně exprimovaných miRNA v buněčných liniích HPV pozitivních a HPV negativních odvozených od nádorů různé anatomické lokalizace
Krbušek, David ; Saláková, Martina (vedoucí práce) ; Dostálová Merkerová, Michaela (oponent)
MikroRNA (miRNA) jsou malé nekódující RNA regulující genovou expresi. Expresní profily miRNA ukázaly řadu diferenciálně exprimovaných miRNA specifických pro nádory asociované s lidskými papilomaviry (HPV). Mezi tyto miRNA se řadí miR-139-5p, která má v těchto nádorech sníženou expresi. V diplomové práci proto byla studována role miR-139-5p v in vitro modelech buněčných liniích, které jsou HPV pozitivní (CRL-3240, SiHa) a HPV negativní (FaDu, C-33A). V buněčných linií transfekovaných mimikující miRNA miR-139-5p byla sledována schopnost proliferace a migrace buněk. Buněčná proliferace byla studována pomocí MTT metody, zatímco pro hodnocení migračních schopností buněk byly využity dvě metody, metoda hojení ran a metoda transwell. Za využití databází TargetScan a miRDB byly predikovány mediátorové RNA (mRNA) cílových genů miR-139-5p. Změna exprese cílových genů, stejně jako ověření úspěšného zvýšení exprese miRNA v buněčných liniích, byla ověřena pomocí metody RT-qPCR. Zvýšení exprese miR-139-5p ve všech buněčných liniích nevedlo ke statisticky signifikantním změnám (p≤0,05) v proliferačních ani migračních schopnostech. Jako cíle mimikující miR-139-5p byly vybrány mRNA genů FOS, JUN, KIF13A a GDF10. Transfekované buněčné linie nevykazovaly výrazné snížení exprese cílových mRNA. U buněčné linie SiHa...
|
|
|
Minoritní strukturní proteiny polyomavirů: Vlastnosti a interakce s buněčnými strukturami
Vinšová, Barbora ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
I když jsou polyomaviry intenzivně zkoumány více než 60 let, stále není dostatečně objasněna role minoritních strukturních proteinů VP2 a VP3 v některých důležitých krocích životního cyklu viru, a to zejména jejich úloha při dopravení virového genomu do jádra a také jejich zapojení v pozdní fázi životního cyklu viru. Tato diplomová práce je zaměřena na studium minoritních proteinů Myšího polyomaviru (MPyV) a lidského polyomaviru BK (BKV). V rámci této práce byly připraveny čtyři králičí polyklonální protilátky proti minoritním proteinům virů MPyV nebo BKV. Dvě připravené protilátky jsou namířeny proti minoritním proteinům MPyV (α-MPyV VP2/3) nebo BKV viru (α-BKV VP2/3) a další dvě připravené protilátky rozeznávají společnou C-koncovou sekvenci minoritních proteinů VP2 a VP3 MPyV (α-MPyV C-termVP2/3) nebo BKV viru (α-BKV C-termVP2/3). V druhé části práce jsme se zaměřili na studium toxicity minoritních proteinů polyomaviru BKV při jejich samostatné produkci v savčích buňkách. Získaná data naznačují, že v porovnání s minoritními proteiny VP2 a VP3 viru MPyV, nevykazují minoritní proteiny BKV viru tak vysokou míru cytotoxicity. Třetí část práce je věnována studiu interakcí minoritních proteinů polyomavirů BKV a MPyV s buněčnými proteiny a mezi sebou navzájem. Pomocí připravených protilátek byly...
|
|
|
Nekódující kontrolní oblast genomu lidských polyomavirů
Pešek, David ; Saláková, Martina (vedoucí práce) ; Váňová, Jana (oponent)
Genom lidských polyomavirů sestává přibližně z 5000pb kruhové dvouřetězcové DNA a je rozdělován na tři funkční oblasti - časnou oblast (early viral gene region, EVGR) kódující regulační T antigeny a virové miRNA, nekódující kontrolní oblast (noncoding control region, NCCR) obsahující minimální cis-působící regulační sekvence, které jsou potřebné pro správný průběh virové replikace a pozdní oblast (late viral gene region, LVGR), který je zodpovědný za produkci strukturních kapsidových proteinů. Nekódující kontrolní oblast obsahuje minimální počátek replikace, který se vzájemně překrývá s promotory pro časnou i pozdní transkripci. Sekvence nekódující kontrolní oblasti zahrnují velké množství vazebných míst pro buněčné transkripční faktory, které mají schopnost regulovat expresi z LVGR a EVGR. V této práci byla popsána organizace nejvariabilnější oblasti polyomavirového genomu, NCCR, u polyomavirů SV40, BKPyV a JCPyV. V nekódující kontrolní oblasti často dochází k přestavbám, delecím, a dokonce i k bodovým mutacím, které mají dopad na expresi polyomaviru. Klíčová slova: polyomaviry, nekódující kontrolní oblast, BKPyV , JCPyV , SV40, velký T antigen, buněčné transkripční faktory
|
|
|
Role jaderných tělísek PML při infekci herpesviry
Bártová, Jana ; Šroller, Vojtěch (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
Jaderná tělíska PML jsou proteinové struktury v buněčném jádře, které regulují mnoho důležitých buněčných procesů a uplatňují se mimo jiné i při obraně proti virové infekci. Mezi stálé komponenty těchto tělísek patří proteiny PML, Sp100 a Daxx, mnoho dalších proteinů může s PML tělísky asociovat přechodně. Proteiny PML tělísek mohou být SUMOylovány, tato posttranslační modifikace má význam pro formování PML tělísek a regulaci jejich funkce. Komponenty PML tělísek včetně PML, Sp100 a Daxx se mohou projevovat jako restrikční faktory omezující replikaci mnoha DNA i RNA virů. Obranné mechanismy zprostředkované proteiny PML tělísek jsou potlačovány virovými proteiny, které inaktivují jednotlivé komponenty nebo narušují strukturu PML tělísek. Tato práce se zaměřuje na význam PML tělísek a jejich komponent jako restrikčních faktorů při infekci DNA viry z čeledi Herpesviridae a popisuje interakce mezi PML tělísky a virovými proteiny na příkladech herpes simplex viru 1, lidského cytomegaloviru a viru Epstein-Barrové. Klíčová slova: jaderná tělíska PML, restrikční faktor, protivirová obrana, vrozená imunita, herpesviry
|
host ::
RSS.