|
|
Targeting insulin storage forms in pancreatic β-cell secretory granules
Asai, Seiya ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Skořepa, Ondřej (oponent) ; Koblas, Tomáš (oponent)
V této disertační práci jsme se zaměřili na komplexní výzkum zaměřený na produkci, skladování a sekreci inzulínu -buňkami pankreatu. Úspěšně jsme vyvinuli nový test pro rychlé a citlivé stanovení koncentrace inzulínu v biologických vzorcích. Tento test, založený na kompetici měřeného vzorku s radioligandem o inzulínový receptor, nám pomohl určit vliv různých nízkomolekulárních látek, ale i peptidů, na sekreci inzulinu. Zjistili jsme, že arginin a ornitin mají na dávce závislý stimulační účinek na glukózou stimulovanou sekreci inzulínu z −buněk, ale že dopamin sekreci inzulinu inhibuje. Účinek serotoninu na sekreci inzulinu byl nejednoznačný. Studovali jsme také účinky kostního proteinu osteokalcinu a jeho fragmentů na sekreci inzulínu. Zjistili jsme, že tyto peptidy nestimulují sekreci inzulinu z -buněk, ale že osteokalcin může mít proliferační vlastnosti. Testovali jsme také vliv tryptofanu a jeho metabolitů a zjistili jsme, že tyto sloučeniny nestimulují sekreci inzulinu, ale že některé z nich ji mohou ve vyšších koncentracích sekreci inhibovat. Významným výsledkem studie je experimentální potvrzení přítomnosti krystalického inzulinu v sekrečních granulích -buněk. Jedná se o první přímý důkaz, že za nativních podmínek může být inzulín v buňkách uložen ve formě mikrokrystalů. Celkově jsme...
|
|
|
Charakterizace pankreatických beta-buněk po jejich stimulované proliferaci syntetickými modifikovanými mRNA
Veľasová, Adriana ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Diabetes mellitus je chronické onemocnění způsobené ztrátou beta-buněk slinivky břišní, ke které dochází v důsledku autoimunitní destrukce, či zvýšené apoptózy beta-buněk. Nedostatek beta-buněk má za následek sníženou produkci insulinu, který hraje významnou roli v metabolismu glukosy. Počet beta-buněk organismu je jedním z hlavních faktorů, který ovlivňuje vznik tohoto chronického onemocnění. Z tohoto důvodu bylo vhodné nalézt způsob, pomocí kterého by bylo možné počet beta-buněk organismu navýšit a obnovit tak přirozenou cestou produkci insulinu bez jakékoliv nutnosti využívání insulinových infuzí. Schopnost buněčného dělení beta-buněk ovšem s věkem klesá a v dospělosti je prakticky nulová. Nadějnou cestou k obnově insulin produkující tkáně se tak jeví studium buněčného cyklu beta-buněk, především poté časných a pozdních cyklinů a cyklin dependentních kinas, které působí jako regulátory buněčného cyklu. S cílem zvýšit počet beta-buněk vstupujících do buněčného cyklu jsme se zaměřili na studium vlivu in vitro připravených (IVT) mRNA cyklinů typu D a cyklin dependentních kinas 4 a 6 na stimulaci buněčného dělení izolovaných beta-buněk. Zjistili jsme, že transfekce IVT mRNA pro cykliny typu D v kombinaci s cyklin dependentními kinasami 4 a 6 výrazně zvyšuje proliferaci beta-buněk uvězněných v klidové fázi...
|
|
|
Stimulace proliferace beta-buněk pankreatu pomocí syntetických modifikovaných mRNA kódující geny regulátorů buněčného cyklu
Ivanovská, Dana ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
je metabolické onemocnění, které se projevuje dlouhodobě zvýšenou krvi. Hyperglykémie je způsobena ztrátou pankreatických inzulín produkujících beta buněk. V případě diabetu mellitu II. typu bývá také spojena Z toho důvodu by náhrada nebo regenerace beta buněk pacientů. V současné době se vědecký výzkum zaměřuje stimulaci proliferace pankreatických beta buněk. potenciálně vhodné molekuly pro indukci proliferace beta buněk. Tyto proteiny řídí vstup buňky do buněčného cyklu. Cílem této bakalářské práce bylo ověřit možnost navození proliferace beta buněk prostřednictvím synteticky připravených mRNA cyklinů typu D syntetizovaných mRNA umožnuje krátkodobě zvýšenou expresi příslušných proteinů. Dále byly také využity mutované formy cyklinů D, které vyznačují vyšší stabilitou a tedy i delším poločasem života. Po transfekci sociovaných Langerhansových ostrůvků byla detekována přítomnost cyklinů typu D Cdk4/6 metodou nepřímé imunofluorescence. Současně byla také provedena metoda Western blotu s následnou imunodetekcí proteinů. Transfekce potkaních Langerhansových ostrůvků rů pro cykliny typu D s Cdk4/6 vedla ve všech případech k výrazné indukci proliferace potkaních beta buněk. Míra proliferace se pohybovala v rozmezí − kombinaci transfekovaných syntetických mRNA, kdežto u kontrolní netransfekovaných beta buněk byla...
|
|
|
Charakterizace beta buněk pankreatu po jejich in vitro stimulované proliferaci syntetickými modifikovanými mRNA
Veľasová, Adriana ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Vznik diabetu mellitu I., či II. typu přímo souvisí s homeostázou proliferace a apop- tosu β-buněk Langerhansových ostrůvků slinivky břišní. Jakákoliv dysbalance, která vede k úbytku v množství β-buněk organismu zvyšuje pravděpodobnost vzniku to- hoto onemocnění. Pacienti trpící diabetem mellitem jsou odkázáni na částečnou, či úplnou substituci insulinu alternativními cestami, neboť jejich pankreas není scho- pen pokrýt potřeby insulinu organismu. S cílem obnovy přirozené produkce insulinu u pacientů trpících diabetem mellitem dochází k hledání optimálního způsobu, který by zajistil navýšení počtu β-buněk organismu a tím obnovil fyziologickou produkci insulinu. Velkou překážkou se v tomto ohledu jeví nízká citlivost diferencovaných β- buněk k mitogenním signálům, které by mohly zajistit vstup β-buněk do buněčného cyklu. Znovuobnovení buněčného cyklu β-buněk souvisí s G0/G1/S přechodem buněč- ného cyklu, který je pod kontrolou retinoblastomového proteinu (RB). RB musí být pro vstup do buněčného cyklu fosforylován, přičemž fosforylaci zajišťují cyklin de- pendentní kinasy 4 a 6, které asociují s cykliny rodiny D. V rámci této práce byl proto sledován vliv IVT mRNA (in vitro transkribované mRNA) na proliferaci potkaních β-buněk. Transfekce IVT mRNA pro kombinace homologů cyklinů D a cyklin de-...
|
|
| |
|
|
Slepičí protilátky jako nástroj imunodetekce cytochromů P450
Mácová, Iva ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Koblas, Tomáš (oponent)
Cytochrom P450 je významný enzym katalyzující velké množství reakcí metabolismu endogenních i exogenních látek. Existují látky, které zvyšují expresi tohoto enzymu, což může vést k aktivaci karcinogenů a vzniku rakoviny. Mezi tyto látky patří i dnes velmi propagované chemopreventivní látky, které jsou masově užívané ve formě potravinových doplňků. Je tedy důležité mít k dispozici metody k určení indukce cytochromu P450. Jednou z takových metod je imunodetekce cytochromu P450 metodou Western blotting. K detekci proteinů na membráně slouží specifické protilátky získané většinou ze savců. V této bakalářské práci je dokázáno, že stejně dobře však mohou posloužit i protilátky získané ze slepičích vajec. Těmito vaječnými protilátkami byly detekovány cytochromy P450 1A1 a 1A2 v jaterních mikrosomech po exposici potkanů modelové chemopreventivní látce β-naftoflavonu.
|
|
| |
|
|
Příprava a charakterizace antipeptidových protilátek pro imunodetekci cytochromů P450
Mácová, Iva ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Koblas, Tomáš (oponent)
Cytochromy P450 jsou významné enzymy účastnící se metabolismu endogenních i exogenních látek. Jejich substrátem jsou také karcinogeny, které mohou aktivovat, čímž může docházet ke vzniku rakoviny. Pokud jsou tedy cytochromy P450, zodpovědné za aktivaci karcinogenů indukovány, riziko rakoviny se zvyšuje. Jedním z induktorů těchto enzymů jsou i chemopreventivní látky, které jsou v současnosti velmi oblíbené a doporučované. Proto by měl být sledován vliv chemopreventivních látek na cytochromy P450 a vznik rakoviny. Cytochromy P450 se nejčastěji vyskytují v játrech. Nicméně existují také formy, které nebyly dosud prokázány v žádné zdravé lidské tkáni, ale jejich zvýšená exprese byla zjištěna v nádorech. Z tohoto důvodu by mohly sloužit k diagnostice a prognóze rakoviny. Mezi tyto cytochromy patří CYP2S1 a 2W1, které mohou být prognostickými markery kolorektální rakoviny. Proto by bylo vhodné mít nástroje k detekci těchto enzymů. Jednou z možností je imunodetekce cytochromů P450 technikou "Western blot" pomocí specifických protilátek. Nyní jsou nejčastěji využívány savčí protilátky (IgG), avšak protilátky izolované z vaječného žloutku (IgY) získávají na popularitě zejména kvůli velkému množství nesporných výhod. Pro přípravu peptidických imunogenů byly nejprve z primární struktury CYP2S1 a 2W1 vybrány...
|
|
| |
|
|
Diferenciace dospělých kmenových buněk na inzulín produkující beta buňky
Koblas, Tomáš
disertační práce: Diabetes mellitus je chronické onemocnění charakterizované metabolickou poruchou při relativním nebo absolutním nedostatku inzulínu. Diabetes mellitus 1. typu (DM1) je způsoben autoimunitní reakcí, která postupně vede k selektivní destrukci inzulín produkujících beta- buněk pankreatu. Důsledkem je minimální nebo zcela chybějící tvorba vlastního inzulínu, která vede k závislosti na podávání exogenního inzulínu. DM je také příčinou řady pozdních komplikací. Přestože dlouhodobé přiblížení fyziologické hladině glykémie s použitím intenzifikovaných inzulínových režimů může manifestaci diabetických komplikací oddálit, dosáhnout takovéto kompenzace se však daří jen asi u 5% pacientů. Z toho je patrné, že současné způsoby léčby nevedou ani k vyléčení diabetu, ale většinou ani k prevenci pozdních komplikací. Jedním z nejatraktivnějších léčebných přístupů je proto takový způsob léčby, který by nahradil chybějící inzulínovou sekreci. Takovou metodou je transplantace inzulín produkující tkáně. Nedostatečný počet dárců je ovšem hlavním limitujícím faktorem pro využití tohoto léčebného postupu v širším měřítku. Je tedy patrné, že pro získání dostatečného množství inzulín produkující tkáně musí být nalezeny alternativní zdroje. V současné době se jako nejnadějnější jeví využití kmenových buněk....
|
host ::
RSS.