|
|
Characterization of protein structures using chemical cross-linking and mass spectrometry.
Kukačka, Zdeněk ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Rozbeský, Daniel (oponent) ; Hernychová, Lenka (oponent)
Některé bílkoviny k plnění své funkce vyžadují přítomnost specifického ligandu, kofaktoru nebo prostetické skupiny. Vazba této specifické molekuly může v molekulách bílkovin způsobit konformační změny. V některých případech může charakterizace takovýchto konformačních změn představovat velmi náročný úkol. V předkládané práci je popsán nový přístup sloužící ke sledování těchto změn pomocí kombinace chemického zesítění a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením. Na modelovém systému, kterým byl zvolen protein kalmodulin, je ukázáno, že analýza pomocí izotopově značených síťovacích činidel umožnuje získat přehled o změnách struktury způsobených přítomností nebo nepřítomností ligandu. Byly rovněž popsány potenciální nedostatky metody, které tkví především v nedostatečné proteolýze proteinu. Tato nová metoda, která zároveň umožňuje kvantifikaci strukturních změn proteinů, byla použita spolu s dalšími technikami k charakterizaci neutrální trehalasy Nth1 v komplexu s proteinem Bmh1 (kvasinková forma proteinu 14-3-3). Výsledky odhalily, že vazba proteinu Bmh1 vyvolává přeskupení molekuly Nth1 se změnami především v tzv. "EF-hand" podobném motivu, který je nezbytný pro aktivační proces.
|
|
|
Studium interakce mezi DNA a transkripčními faktory pomocí hmotnostní spektrometrie.
Slavata, Lukáš ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Transkripční faktory hrají v rámci buňky i celého mnohobuněčného organismu zásadní regulační úlohu. Důležitým faktorem, je jejich schopnost interagovat s ostatními regulačními proteiny a DNA. Přesto, že rozsáhlá část této interakční sítě je již zmapována, detailních informací o struktuře a dynamice protein-proteinových a protein-DNA komplexů je dosud velmi málo. V této práci jsme se zaměřili na možnosti studia konformačních změn daných tvorbou komplexu transkripčního faktoru s DNA pomocí strukturních metod hmotnostní spektrometrie: vodík/deuteriové výměny a chemického sítění. Jako modelový transkripční faktor jsme vybrali FOXO4, jehož DNA vazebná doména je strukturně dobře charakterizovaná jak ve volné formě, tak v komplexu s DNA (In Czech).
|
|
|
Studium interakce lektinových receptorů přirozených zabíječů s jejich proteinovými ligandy.
Hernychová, Lucie ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
NK buňky jsou přirozené lymfocyty, které tvoří díky svému receptorovému systému první linii obrany organismu před infekcemi. Jsou důležitou součástí protivirové, ale také protinádorové imunity, hrají roli v transplantační imunitě, autoimunitě nebo reprodukci. Tato diplomová práce se zabývá studiem struktury membránového receptoru NKR-P1B myších NK buněk a jeho interakcí s ligandem Clr-b. Cílem bylo připravit expresní vektor kódující ligand-vazebnou a celou extracelulární část receptoru NKR-P1B a optimalizovat jeho produkci a renaturaci in vitro. Připravené proteiny byly analyzovány gelovou filtrací, elektroforeticky a hmotnostní spektrometrií. Poté byla sledována jejich interakce s proteinem Clr-b biofyzikálními (gelová filtrace a povrchová plazmonová rezonance) a biologickými metodami (značení buněčných preparátů proteiny NKR-P1B s navázanou fluorescenční sondou). In vitro vazebné pokusy nepotvrdily vzájemnou intarakci NKR-P1B a Clr-b, přestože se připravené proteiny vázaly na buňky z kostní dřeně.
|
|
|
Studium vlivu kofaktoru na strukturu proteinu pomocí hmotnostní spektrometrie
Rosůlek, Michal ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Bakteriální protein WrbA z E. coli je zakládajícím členem nové rodiny FMN dependentních NAD(P)H oxidoreduktas, tvořící funkční i strukturní vývojový stupeň mezi bakteriálními flavodoxiny a některými savčími NAD(P)H:chinon oxidoreduktasami. Z těchto důvodů je protein WrbA v poslední době intenzivně studován pomocí různých analytických metod i počítačových simulací. Protein WrbA participuje na ochraně buněk před oxidativním stresem, přesná funkce proteinu WrbA in vivo je však stále neznámá. Protein WrbA tvoří v roztocích multimery, v μM koncentracích se při nízkých teplotách (4 řC) nachází ve formě dimeru, s rostoucí teplotou tetramerizuje. Dostupné trojrozměrné krystalové struktury obsahují informace pouze o tetramerní formě proteinu, dimerní forma dosud nebyla strukturně charakterizována. Tato práce byla zaměřena na studium dynamického chování proteinu v roztoku metodami vodík-deuteriové výměny a chemického síťování s následnou analýzou hmotnostním spektrometrem s vysokým rozlišením (FT-ICR). Sledováno bylo chování proteinu v závislosti na vazbě kofaktoru FMN nebo změnách teploty a koncentrace. Analýzou dat z vodík-deuteriové výměny byly získány informace o přístupnosti rozpouštědla a dynamice pro kompletní sekvenci proteinu. Popsán byl stabilizační vliv kofaktoru na tetramerní strukturu proteinu,...
|
|
|
Studium struktury receptoru DCL-1 pomocí hmotnostní spektrometrie
Růžičková, Barbora ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Mrázek, Hynek (oponent)
DCL-1 (CD302) je transmembránový C-lektinový receptor typu I, který je exprimován na monocytech, makrofázích, granulocytech a dendritických buňkách. Jeho extracelulární doména však postrádá aminokyselinové motivy, esenciální pro vazbu sacharidových struktur v přítomnosti vápenatých kationtů, což naznačuje, že nemá klasickou vazebnou aktivitu typickou pro C-lektinové receptory jako například manosový receptor. Žádné jeho exogenní nebo endogenní ligandy ovšem nebyly dosud nalezeny. V důsledku vnitřní kolokalizace s F-aktinem lze předpokládat, že tento nekonvenční lektinový receptor hraje důležitou roli nejen v endocytóze a fagocytóze, ale také v buněčné adhezi a migraci. Receptor DCL-1 byl poprvé identifikován jako genetický fúzní partner lidského multilektinového receptoru DEC-205 v buněčné linii Hodgkinova lymfomu. Experimentální část této práce se zabývá identifikací zapojení disulfidických vazeb a získání dat k validaci krystalové struktury DCL-1. Nejprve byla provedena optimalizace podmínek produkce a renaturace za účelem získat co největší množství proteinu DCL-1, resp. jeho extracelulární domény. Optimální podmínky byly využity k přípravě proteinu, se kterým bylo provedeno štěpení v gelu specifickými endopeptidasami za přítomnosti cystaminu následované LC-MS analýzou. Porovnáním naměřených dat z LC-MS...
|
|
|
Studium konformačních změn proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie.
Rosůlek, Michal ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Proteiny a enzymy, které ke své aktivitě vyžadují přítomnost specifického ligandu, kofaktoru, popřípadě prostetické skupiny, podléhají po navázání příslušných molekul konformačním změnám, umožňujících efektivně vykonat jejich funkci. V některých případech jsou tyto změny běžnými strukturními metodami těžko postižitelné. Využitím metody chemického zesítění s analýzou produktů pomocí hmotnostní spektrometrie lze konformační změny takovýchto proteinů zaznamenat a s nízkým rozlišením i vizualizovat. Tato práce se zabývá studiem konformačních změn indukovaných vazbou ligandu, kationtu vápníku, na molekulu modelového proteinu kalmodulinu. Kalmodulin plní funkci druhého posla v několika odlišných buněčných signalizačních drahách. Tato funkce je úzce spjata s dostatečným dynamickým rozsahem molekuly kalmodulinu. Díky této vlastnosti je kalmodulin vhodným proteinem pro identifikaci konformačních změn. Využitím činidel chemického zesítění DSG a DSS, reagujících selektivně s primárními aminy lysinů, s různou délkou spojovacího raménka, bylo po štěpení trypsinem a separaci produktů vysokoúčinnou kapalinovou chromatografíí s následnou hmotnostně spektrometrickou analýzou nalezeno sedm unikátních intraproteinových spojení. Použitím izotopově neznačených činidel v reakční směsi v přítomnosti vápenatých kationtů a...
|
|
|
Výzkum Struktury β-N-Acetylhexosaminidasy z Penicillium oxalicum.
Krunclová, Tereza ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
v češtině β-N-Acetylhexosaminidasa (EC 3.2.1.52) je exoglykosidasa, která má ve vláknitých houbách unikátní vlastnosti. Enzym z těchto organismů je dimerní, inducibilní a extraceluárně sekretovaný. Je exprimovaný jako preproprotein, skládá se ze signální sekvence, dlouhého propeptidu a katalytické podjednotky. Ačkoli je enzym široce rozšířen, jeho struktura se v jednotlivých organismech liší. Bakterie mají hexosaminidasy pouze monomerní. Lidské enzymy jsou stejně jako fungální dimerní, ale jen hexosaminidasy z vláknitých hub mají katalytickou podjednotku asociovanou nekovalentně s propeptidem. Propeptid je nezbytnou součástí aktivního enzymu. Existuje homologní model katalytické podjednotky β-N-acetylhexosaminidasy z Penicillium oxalicum, ale struktura propeptidu zatím vyřešená nebyla. Tato diplomová práce se v první části zabývá optimalizací podmínek produkce a purifikace. V druhé části se zabývá strukturními studiemi β-N-acetylhexosaminidasy z vláknité houby Penicillium oxalicum CCF 3438. Tyto studie byly prováděny pomocí metod chemického sítění a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením. Kombinací těchto metod byla odhalena místa nekovalentní interakce katalytické podjednotky a propeptidu. (In Czech)
|
|
|
Výzkum Struktury β-N-Acetylhexosaminidasy z Aspergillus oryzae
Kukačka, Zdeněk ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
v češtině β-N-acetylhexosaminidasa (EC 3.2.1.52) patří do skupiny exoglykosidas a vyskytuje se prakticky u všech organismů od bakterii po člověka. Plísňová β-N-acetylhexosaminidasa z Aspergillus oryzae se skládá z propeptidu a katalytické podjednotky. Propeptid je na katalytickou podjednotku vázán nekovalentně a je nezbytný pro aktivitu enzymu. Ačkoli struktura katalytické podjednotky byla navržena pomocí homologního modelování, struktura propeptidu ještě doposud odhalena nebyla. V této studii jsme se snažili nalézt oblast, kde se propeptid na katalytickou podjednotku váže. Předkládaná práce se skládá ze dvou částí. První část se zabývá optimalizaci podmínek produkce, purifikace a krystalizace β-N-acetylhexosaminidasy z vláknité houby Aspergillus oryzae. Druhá část je věnována samotnému studiu interakce propeptidu a katalytické podjednotky, která byla charakterizována technikou chemického zesítění. A právě prostřednictvím chemického zesítění a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením byly odhaleny ne jenom strukturní změny katalytické podjednotky, které jsou závislé na přítomnosti či nepřítomnosti propeptidu, ale i oblasti, kde propeptid interaguje s katalytickou podjednotkou.
|
|
|
Výzkum vzájemné interakce membránových receptorů NKR-P1D a Clrb
Hanč, Pavel ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Brdička, Tomáš (oponent)
Výzkum vzájemné interakce membránových receptorů NKR-P1D a Clrb Interakce myších receptorů NKR-P1D a Clrb byla poprvé popsána jako nový typ "MHC class-I independent missing-self recognition" poskytující ochranu před NK buněčným zabíjením.[1] Pozdější studie ale přinesla výsledky zpochybňující tato data a naznačující, že NKR-P1D váže Clrb pouze velmi slabě, jestli vůbec.[2] Abychom vnesli světlo na tyto diskrepantní výsledky, rekombinantě jsme připravili extracelulární domény obou receptorů v bakteriích E. coli a proteiny renaturovali in vitro. Kvalita renaturace byla ověřena určením zapojení disulfidických můstků a změřením 1 H/15 N-HSQC spekter. Pomocí gelové filtrace a analytické ultracentrifugy nebylo možno poskytnout přesvědčivé důkazy pro existenci interakce. Slabá, ale specifická interakce byla pozorována za použití SPR techniky. Tato interakce překvapivě vykazovala pH závislost. Interakce mezi proteiny v roztoku byla následně imobilizována pomocí techniky chemického zesítění proteinů. Byla použita činidla EDC, DSG a DSS. Reakční směsi byly rozděleny pomocí SDS-PAGE a dimery byly štěpeny proteasami v gelu. Pomocí FTMS bylo možné identifikovat peptidy z obou proteinů, které byly spojeny některým ze síťovacích činidel. Díky nedávno vyřešeným strukturám proteinů NKR-P1A a Clrg, které sdílí s NKR-P1D a...
|
|
| |
host ::
RSS.