|
| |
|
|
Proteomová analýza buněčné proliferace a diferenciace na modelech nervových kmenových buněk a nádorových buněk
Skalníková, Helena ; Kovářová, Hana (vedoucí práce) ; Anděrová, Miroslava (oponent) ; Bezouška, Karel (oponent)
6 ZÁVĚR 27 6 ZÁVĚR U nervových kmenových buněk byly pomocí dvojrozměrné gelové elektroforézy a následné hmotnostní spektrometrie identifikovány konstitutivně syntetizované proteiny v 66 proteinových skvrnách. Nejčastěji byly zastoupeny proteiny účastnící se metabolismu a úprav RNA a proteinů, následované cytoskeletárními proteiny a anexiny, metabolickými proteiny a enzymy, proteiny účastnící se tvorby energie, obrany buňky a buněčných signalizací. Bylo identifikováno 16 proteinů, jejichž hladina se statisticky významně měnila během diferenciace nervových kmenových buněk do nervových buněk. Zvýšení hladiny α- B crystallinu, hnRNP A1 a hnRNP A2/B1 a jejich lokalizace v nervových buňkách byly potvrzeny imunoblotem a imunocytochemií. Pomocí protilátkových mikročipů byly u nervových kmenových buněk detekovány fosforylace signálních proteinů související většinou s buněčnou proliferací (CDK1 a 2, PKC mu, PKCγ, Erk5 a α-B crystallinu) a zvýšená hladina proteinu GRK2. Naopak u diferencovaných buněk byl prokázán nárůst hladiny protein fosfatázy 4 (její katalytické podjednotky), hem-oxygenázy 2, kináz MEK3 a RafB a pro-kaspázy 1 a zvýšená fosforylace 40 kDa substrátu Akt kinázy bohatého na prolin. U nádorových buněk bylo po separaci proteinů systémem ProteomeLabTM PF 2D identifikováno 8 proteinů, jejichž hladina byla...
|
|
| |
|
| |
|
|
Carbohydrate dimers in tumor immunotherapy
Krupová, Monika ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Využití sacharidových dimerů v imunoterapii nádorů Monika Krupová (Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze) Jednou ze strategií pro imunoterapii nádorů je aktivace cytotoxických lymfocytů pomocí ligandů specifických pro jejich povrchové receptory. CD69 je široce rozšířeným receptorem na povrchu mnoha buněk hematopoietického původu, a protože jeho fyziologický ligand nebyl zatím popsán, na modulaci jeho funkcí se dají použít různá ligandová mimetika. Mimetika testované v předkládané práci jsou založené na mono- či disacharidech spojených pomocí dvou různých funkčních skupin, které tvoří thiomočovinovou a triazolovou sérii. Při precipitačních studiích byla sledována schopnost precipitovat rozpustný NKR-P1 a CD69 receptor, přičemž se zjistilo, že optimalizovaná délka spojky pro navázání látky na NKR-P1 receptor je decyl. Naproti tomu aktivace receptoru CD69 neni až tak závislá na délce spojky. Cílem této práce bylo z imunologického hlediska prozkoumat vlivy jednotlivých testovaných látek na bunečnou signalizaci, cytotoxicitu vůči buňkám nádorové linie a aktivaci vyvolanou apoptózu. Největší vliv na signalizaci, sledovanou pomocí produkce inositolfosfátů a vápenatých iontů a stejně tak na přirozené zabíjení, měly látky triazolové série obsahující ve své molekule dva...
|
|
|
Structure and function of C-type lectin NK cell receptors studied by recombinant expression and protein crystallography
Vaněk, Ondřej ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze 2010 Struktura a funkce C-lektinových receptorů NK buněk studovaná pomocí rekombinantní exprese a proteinové krystalografie Abstrakt dizertační práce Ondřej Vaněk Školitel: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. NK buňky (přirození zabíječi) byly popsány pro jejich schopnost spontánně zabíjet určité allogenní nádorové linie, a to bez jakékoliv předchozí senzitizace. NK buňky jsou součástí neadaptivní imunitní odpovědi s velmi krátkou reakční dobou vůči patogenům, jakými jsou například viry, intracelulární bakterie a parazité. Jsou také zodpovědné za eliminaci některých rakovinných buněk a mohou tak bránit rozvoji nádorové transformace a bojovat proti rozšiřování metastáz. Aktivita NK buněk je regulována pomocí rovnováhy mezi aktivačními a inhibičními signály zprostředkovanými povrchovými receptory NK buněk. Ze strukturního hlediska může být většina NK buněčných povrchových receptorů klasifikována jako C- lektinové nebo imunoglobulinové receptory. Jednou z mnoha podskupin C-lektinů jsou i lymfocytární receptory II. typu, které jsou exprimovány na NK buňkách. Předkládaná práce měla dva hlavní cíle. Prvním bylo nalezení vhodných expresních a purifikačních systémů pro vybrané C-lektinové receptory NK buněk a druhým pak provést jejich biochemickou a...
|
|
|
Příprava konstruktů pro transgenní expresi DPP-IV a FAP
Košek, Dalibor ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Křepela, Evžen (oponent)
Příprava konstruktů pro transgenní expresi DPP-IV a FAP Bc. Dalibor Košek Abstrakt: Skupina proteinů DASH (Dipeptidylpeptidase IV aktivitou a/nebo strukturou homologní) představuje soubor multifunkčních molekul, z nichž většina vykazuje peptidasovou aktivitu podobnou dipeptidylpeptidase IV (DPP-IV, EC 3.4.14.5, identická s diferenciačním antigenem lymfocytů CD26). Z proteinů i peptidů obecně odštěpují N-terminální X-Pro dipeptid. Tato práce byla zaměřena na dva proteiny, DPP-IV/CD26, kanonického představitele DASH, a fibroblastový aktivační protein alfa (FAP-α). Jedná se o transmembránové proteiny II. typu s rozdílnou tkáňovou distribucí, u nichž jsou však známé i extracelulární rozpustné varianty. Z dosavadních poznatků vyplývá, že oba mají význam v procesech vzniku a rozvoje mnoha nádorových onemocnění a to mechanismy závislými i nezávislými na enzymatické aktivitě. Pro objasnění jejich úlohy v gliomagenesi bylo navrhnuto připravit experimentální model v podobě glioblastomových buněčných linií s definovatelným fenotypem DPP-IV/CD26 a FAP-α. Bude zahrnovat enzymaticky neaktivní formy proteinů i analogy s různým subcelulárním směřováním. Takovýto model dovolí posoudit vliv DPP-IV/CD26 a FAP-α na rozvoj gliálního nádoru, význam jejich enzymové aktivity a subcelulární distribuce v tomto procesu. Experimenty...
|
|
|
Optimalizace rekombinantní exprese proteinů v HEK293 buněčné linii
Bláha, Jan ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Šácha, Pavel (oponent)
Savčí buňky jsou dominantním systémem pro rekombinantní expresi farmaceutických proteinů. S rozvojem metodiky transientní transfekce savčích buněk se tento systém stává vhodným také pro strukturní biologii. Tato práce se zabývala optimalizací rekombinantní exprese v buněčných liniích HEK293T a HEK293-6E v různých médiích za použití snadno stanovitelných reportérových proteinů - sekretované alkalické fosfatasy (SEAP) a zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). Důraz byl kladen na optimalizaci klíčových faktorů tvorby transfekčního komplexu - poměru DNA a polyethyleniminu a množství vložené DNA. Sledován byl i pozitivní vliv inhibitoru histonových deacetylas kyseliny valproové a dále kaseinového hydrolyzátu Tryptone N1.
|
|
|
Analýza vlivu glykosylace na poskládání a molekulární architekturu enzymů
Horáková, Jana ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
V rámci zaměření naší laboratoře na studium vlivu glykosylace na proteinovou architekturu a biologickou aktivitu plísňových hexosaminidase jsem pro experimenty zvolila enzym z Penicillium oxalicum. Jeho hlavní výhodou je relativně homogenní glykosylace, propeptid tohoto enzymu je přirozeně glykosylovaný pouze na dvou místech, asparaginu 11 a serinu 66. Katalytická podjednotka a propeptid enzymu hexosaminidasy z Aspergillus oryzae byly pro rekonstituční experimenty odděleny od sebe. Cílenou mutagenesí byly v propeptidové části enzymu izolovaného z Penicillium oxalicum vyměněny asparagin 11 a serin 66 za cystein vhodný ke glykosylaci. Velkou nadějí pro účinné navrácení (rekonstituci) enzymové aktivity představoval nově syntetizovaný propeptidový derivát celobiosy, který je nejvíce podobný přirozeně se vyskytujícímu cukru chitobiose. Glykosylovaný propeptid byl oddělen od neglykosylovaného. Pomocí rekonstitučních experimentů jsme zjišťovali vliv glykosylace na enzymovou strukturu a aktivitu s využitím různě glykosylovaných propeptidů. Největší účinnost nastala při rekonstituci s původním propeptidem. V dalších pokusech byly zahrnuty kombinace synteticky glykosylovaných propeptidů, z nichž největší účinnost měla celobiosa (Asn11 ) - manosa (Ser66 ) a N-acetylglukosamin (Asn11 ) - manosa(Ser66 )....
|
|
| |
host ::
RSS.