|
|
Příprava a charakterizace syntetické mRNA kódující pankreatické transkripční faktory
Loukotová, Šárka ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Jirák, Daniel (oponent)
Diabetes mellitus 1. typu je závažné autoimunitní onemocnění, při kterém v pankreatu dochází k zániku β-buněk produkujících insulin. Pacienti postižené tímto onemocněním jsou odkázáni na celoživotní zevní podávání insulinu. V současné době je jedinou dostupnou léčebnou metodou buď transplantace celého orgánu pankreatu, nebo izolovaných Langerhansových ostrůvků. Kvůli nedostatku vhodné tkáně k transplantaci a náročné léčbě diabetu probíhá intenzivní výzkum nových alternativních zdrojů buněk produkujících insulin. Jednou z metod přípravy buněk produkujících insulin je tzv. transdiferenciace pankreatických exokrinních buněk pomocí specifických transkripčních faktorů. V této práci byla k transdiferenciaci exokrinní buněčné linie AR42J použita in vitro synteticky připravená mRNA kódující transkripční faktory Pdx1, Ngn3 a MafA. Primární sekvence mRNA byla optimalizována pro přípravu velmi stabilní mRNA s vysokou mírou translace. Hlavními stabilizačními prvky mRNA byly 3' a 5' nepřekládaná oblast genu pro β-globinu, jehož mRNA vykazuje životnost až 24 hod. Na základě transfekce do buněk AR42J a následné imunofluorescenční detekce byla ověřena správná funkce synteticky připravené mRNA. Synteticky připravené mRNA pro transkripční faktory Pdx1, Ngn3 a MafA byly následně použity k transdiferenciaci...
|
|
| |
|
|
Kooperativita složek systému cytochromů P450 a ovlivnění metabolismu léčiv a karcinogenů
Holý, Petr ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Chmelík, Josef (oponent)
Systém oxidas se smíšenou funkcí (MFO systém) hraje důležitou roli v metabolismu mnoha endogenních látek a xenobiotik (např. karcinogenů, léčiv). Membránové hemoproteiny nazývané cytochromy P450 jsou zásadní složkou tohoto systému. Reakce katalyzované cytochromy P450 jsou ovlivňovány působením jiného proteinu MFO systému, a to cytochromem b5 (cyt b5). Mechanismus, jakým cyt b5 působí, ještě nebyl zcela objasněn. Jednou z možností studia této protein-proteinové interakce je metoda kovalentního síťování. Záměnou methioninu ve struktuře cyt b5 za jeho foto-aktivovatelný analog (foto-methionin) je možné připravit analog cyt b5 (foto-cyt b5), který po aktivaci UV zářením kovalentně váže cytochrom P450 v membránovém prostředí. Tato práce se zabývá expresí a izolací rekombinantního analogu cyt b5 s pouze jednou pozicí pro methionin (96) v primární struktuře proteinu a jeho substitucí za foto-methionin. Protein byl purifikován s výtěžkem 6 mg na 1 l bakteriální suspenze. Analýza hmotnostní spektrometrií (MALDI-TOF/TOF) ukázala, že methionin byl v sekvenci substituován foto-reaktivním analogem z asi 30 % (pokrytí sekvence 77 %). Foto- cyt b5 byl použit k fixování transientní protein-proteinové interakce s cytochromem P450 2B4 (CYP2B4). Foto-cyt b5 byl rekonstituován v lipidovém systému s CYP2B4 a...
|
|
|
Optimalizace exprese fotoaktivovatelných cytochromů P450 jako nano-sond pro studium membránové topologie enzymů metabolismu léčiv a aktivace karcinogenů
Smolová, Jana ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Cytochromy P450 patří mezi jedny z nejdůležitějších enzymů podílejících se na biotransformaci cizorodých látek v organismu. Jsou součástí tzv. moooxygenasového systému, ve kterém interagují s dalšími enzymy - NADPH:cytochrom P450 reduktasou a cytochromem b5. Vzájemné interakce enzymů v mooxygenasovém systému nejsou zcela rozřešeny. K objasnění možných protein-proteinových interakcí a jejich důsledků by mohla přispět technika kovalentního síťování. Jednou z možností realizace tohoto záměru je využití fotoaktivovatelného cytochromu P450, který by po expozici UV záření vytvořil kovalentní komplex se složkami monooxygenasového systému, s nimiž je v kontaktu. Tato práce se proto zabývá vypracováním optimálních podmínek pro produkci rekombinantního cytochromu P450 2B4 s cílem získat poznatky pro produkci fotoaktivovatelného cytochromu P450 s inkorporovanými aminokyselinami L-fotomethioninem a L- fotoleucinem. V provedených experimentech byl cytochrom P450 2B4 exprimován ve dvou kmenech Escherichia coli, C41 (DE3) a BL21 (DE3) Gold, a ve dvou kultivačních nádobách, skleněné Erlenmayerově baňce a plastové Fernbachově baňce. V průběhu exprese byla měřena optická denzita bakteriální suspenze (absorbance při 600 nm) a koncentrace cytochromu P450. Byla vypracována metodika stanovení koncentrace cytochromu P450...
|
|
|
Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5
Kostelanská, Marie ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Při metabolismu xenobiotik a endogenních látek se uplatňuje monooxygenasový systém, jehož součástí je i cytochrom b5 participující na katalytické činnosti cytochromů P450 (CYP). Mechanismus působení cytochromu b5 v tomto souboru enzymů však nebyl doposud zcela objasněn. Předpokládá se, že se buď přímo podílí na přenosu elektronů v rámci monooxygenasového systému, nebo může alostericky působit na konformaci CYP. Proto je důležité získat co nejčistší apoformu cytochromu b5, která není schopna přenosu elektronů, a dále studovat vliv této nehemové formy cytochromu b5 na činnost CYP. Získané výsledky pak mohou přispět k poznání mechanismu působení cytochromu b5. V průběhu této práce byla provedena transformace bakteriálního kmene buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold expresním vektorem pET22b, který nesl geny pro mikrosomální a erytrocytární formu cytochromu b5. Za účelem produkce vysokého podílu apoproteinové formy byla heterologní exprese cytochromu b5 indukována vyšším přídavkem IPTG a byla provedena při 37řC. Tato bakalářská práce se pak zabývá zejména purifikací jak mikrosomální, tak i erytrocytární formy cytochromu b5 a to hlavně jeho apoformy. Jelikož však při expresi dochází vždy ve větší či menší míře i k produkci hemové formy cytochromu b5, byla i ta izolována. Holo- a apoproteinová forma...
|
|
|
Příprava a charakterizace bakteriálního proteinu YddV (globin obsahující kyslíkový senzor s diguanylát cyklasovou aktivitou)
Křížová, Věra ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Man, Petr (oponent)
Hemoproteiny jsou velmi důležité pro správnou funkci organismů, ať už se jedná o prokaryota nebo eukaryota. Mezi ty nejznámější se řadí myoglobin, hemoglobin, různé peroxidasy nebo cytochromy. Nově byla tato skupina proteinů rozšířena o hem obsahující senzorové proteiny. Jedná se o proteiny složené ze dvou domén. Senzorové, která je schopna detekovat signál (hem nebo plyn), a funkční, která je často enzymem nebo transkripčním faktorem. Aktivita funkční domény závisí na koncentraci signální molekuly, jejíž vazba na senzorovou doménu způsobuje změnu struktury této domény a následnou změnu struktury domény funkční. Hem obsahující senzorové proteiny se dále dělí na hem detekující a plyn detekující proteiny. Hem detekující proteiny mají mnoho společných znaků, například vazbu hemu na thiolátový zbytek cysteinu, CP motiv atd. Plyn detekující proteiny detekují molekulu plynu, nejčastěji se jedná o kyslík, oxid uhelnatý a oxid dusnatý. V minulosti byla provedena řada studií zaměřených na hem obsahující senzorové proteiny, avšak stále není znám mechanismus přenosu signálu ze senzorové domény na funkční doménu. Cílem této práce je literární shrnutí dosavadních poznatků o hem obsahujících senzorových proteinech se zaměřením na plyn detekující proteiny. V praktické části práce byl amplifikován a izolován plasmid...
|
|
|
Důležité role hemu: signál pro hem-detekující proteiny a detekční místo v plyn-detekujících proteinech
Fojtíková, Veronika ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
Hem-obsahující senzorové proteiny jsou hemoproteiny, které jsou rozděleny do dvou skupin: hem-detekující a plyn-detekující proteiny. Funkce hem-detekujících proteinů je ovlivněna koncentrací hemu v okolí proteinu. Prostřednictvím navázání hemu k hem-detekujícímu proteinu (nebo naopak disociace hemu z hem-detekujícího proteinu) jsou ovlivněny mnohé fyziologické procesy v organismu, jako například regulace enzymové aktivity nebo interakce proteinu s DNA a další funkce, které jsou nezbytné pro přežití buněk. Plyn-detekující proteiny obsahují pevně vázanou molekulu hemu, ke které jsou vázány molekuly plynu (např. kyslík, oxid uhelnatý nebo oxid dusnatý) v závislosti na koncentraci molekul plynu. Navázání molekuly plynu k plyn-detekujícímu proteinu, aktivuje mechanismus, jehož prostřednictvím dochází k ovlivnění fyziologických procesů v organismu, jako například regulace enzymové aktivity nebo interakce proteinu s DNA. V této bakalářské práci jsou shrnuty dosavadní zjištěné poznatky o těchto hemoproteinech, publikované v odborných časopisech. Experimentální část této bakalářské práce se zabývá konkrétním modelovým hem-obsahujícím senzorovým proteinem. Je jím histidin kinasa s globinovou strukturou senzorové domény, izolovaná z mikroorganismu Anaeromyxobacter sp., kmen Fw 109-5 (AfGcHK). Náplní experimentální...
|
|
|
Růst Mycobacterium smegmatis na agarovém médiu a agarovém médiu pokrytém celofánovou folií - morfologická a proteomová studie
Ramaniuk, Volha ; Weiser, Jaroslav (vedoucí práce) ; Beranová, Jana (oponent)
Tvorba biofilmů je jednou z nejčastěji používaných strategií umožňujících bakteriím přežít nepříznivé podmínky. Většina bakterií, včetně patogenů jako je například Mycobacterium tuberculosis, je schopna tvořit tyto trojrozměrné struktury. Zástupci rodu Mycobacterium se hojně vyskytují v přírodě, ale mohou způsobit i vážné problémy v případě výskytu ve zdravotnických zařízeních a na umělých náhradách v lidském těle. V našich experimentech jsme použili jako modelový organismus nepatogenní kmen Mycobacterium smegmatis mc2 155. Pomocí binokulární lupy a rastrovací elektronové mikroskopie jsme zkoumali morfologii tří- a šestidenních kolonií (v podstatě biofilmů) na agarových plotnách a agarových plotnách pokrytých celofánem. Zjistili jsme, že typ povrchu, stejně jako zdroj uhlíku, mají velký vliv na morfologii kolonií M. smegmatis. Následně jsme izolovali proteomy z kultur rostoucích na povrchu agaru a celofánu, a z planktonicky rostoucí kultury. Dvojrozměrná elektroforéza byla použita jako hlavní proteomická metoda. Proteinové profily, získané pomocí elektroforetických gelů, byly analyzovány pomocí softwaru PDQuest. Výsledky kvalitativních a kvantitativních analýz jsme porovnali pomocí Vennových diagramů. Identifikovali jsme 7 unikátních bílkovin, které by mohly být specifické pro adhezi M. smegmatis...
|
|
|
Studium inkorporace modifikovaných aminokyselin do cytochromu b5
Koberová, Monika ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Pavlásková, Kateřina (oponent)
Cytochrom b5 (cyt b5) může ovlivňovat reakce katalyzované cytochromy P450, a v důsledku toho se může podílet i na aktivaci látek (například léčiv, karcinogenů) případně ovlivňovat poměry vzniklých metabolitů. Mechanismu působení cyt b5 ještě nebyl zcela objasněn. Přínosem k objasnění mechanismu by mohlo být zjištění protein-proteinových interakcí v monooxygenasovém systému, kterého je tento protein součástí. Pro studium těchto interakcí pomocí síťovacích technik je vhodné připravit fotolabilní cyt b5, který by se po fotoaktivaci stal vysoce reaktivním a vytvořil by komplex s nejbližšími složkami v monooxygenasovém systému.Tato práce se zabývá vypracováním metody pro produkci rekombinantního cyt b5 s modifikovanými aminokyselinami. Cyt b5 byl exprimován v bakteriálním kmeni E.coli BL-21 (DE3) Gold. Před indukcí exprese byly bakterie převedeny do limitního media (DMEM-LM), které neobsahovalo L-leucin a L-methionin. Limitní mediu bylo doplněno modelovou deuterovanou aminokyselinou d3-methyl-L-methioninem a D,L-leucinem. Exprimovaný cyt b5 byl izolován a inkorporace d3-methyl-methioninu byla ověřena hmotnostní spektrometrií. V úvodních experimentech byl cyt b5 získán převážně jako apoprotein (apo-cyt b5). Pro zvýšení inkorporace hemu do apo-cyt b5 byl studován vliv teploty na inkorporaci hemu při...
|
|
|
Příprava expresního systému gama-laktamázy a otestování exprese v E.coli
Magyerková, Monika ; Ingr, Marek (vedoucí práce) ; Šácha, Pavel (oponent)
γ-laktamasa je enzym štěpící pětičlenné laktamové cykly. Jedním z jejích potenciálních substrátů je polyvinylpyrrolidon (PVP). Degradace PVP γ-laktamasou je zkoumána s ohledem na využití v čistírnách odpadních vod. Cílem této práce proto bylo připravit synteticky gen γ- laktamasy z bakterie Comamonas acidovorans a provést jeho klonování do expresního vektoru pET22b. Pro syntézu genu γ-laktamasy byla použita metoda PCA. Sekvence genu γ- laktamasy o délce 1725 bp byla rozdělena do dvou částí (syntonů), které byly syntetizovány samostatně. Po syntéze bylo provedno restrikční štěpení a ligace do vektoru pUC19. Takto připravenými konstrukty byly transformovány kompetentní buňky E. coli kmene DH5α. Po ověření správnosti sekvencí byly oba syntony vyštěpeny restrikčními endonukleasami a spojeny jednokrokovou ligací do plazmidu pET22b. Rekombinantním plazmidem obsahujícím spojené syntony byly transformovány expresní buňky E. coli kmene BL21(DE3)RIL a byla testována exprese rekombinantní γ-laktamasy. Sekvence klonu produkujícío protein odpovídající délky byla potvrzena sekvenční analýzou. Připravený expresní plazmid bude použit pro produkci rekombinantní γ-laktamasy. (In Czech)
|
host ::
RSS.