|
|
Syntéza 5'-UTR varianty PSM-E genu GCPII jako standardu pro RT-PCR
Růžičková, Barbora ; Ingr, Marek (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
V poslední době se pro chemickou syntézu genů stala klíčovým prvkem metoda PCR. V této práci byla využita dvoukroková syntéza DNA založená na PCR k získání 5'-UTR sestřihové varianty PSM-E glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) jako standardu pro qPCR v reálném čase. Dalším cílem práce bylo zaklonovat tuto sekvenci do plazmidu PCRII-TOPO PSM-E, aby mohla být použita k expresi proteinu v hmyzích buňkách v baculovirovém expresním systému. V první PCR reakci byl syntetizován střed sekvence 5'- UTR, který byl následně amplifikován v druhé PCR reakci pomocí prvního a posledního oligonukleotidu. Produkt druhé PCR reakce byl ligován do plasmidu pUC19 a tímto kostruktem byly transformovány bakterie E. coli. Správnost sekvence byla potvrzena sekvenční analýzou. Dále bylo provedeno subklonování insertu z pUC19 do pCRII-TOPO PSM-E a sekvence byla opět ověřena sekvenční analýzou. Získaný konstrukt byl použit jako standard v qPCR v reálném čase ke stanovení koncentrace vzorků mRNA z tkání prostat onkologických pacientů přepsaných reverzní transkripcí do cDNA. Z naměřených amplifikačních křivek standardu byla vytvořena kalibrační křivka, ze které byly odečteny hodnoty koncentrací vzorků cDNA.
|
|
|
Syntéza 5'-UTR varianty Var14 genu GCPII jako standardu pro RT-PCR
Petrovová, Gabriela ; Ingr, Marek (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Cílem této práce bylo připravit syntetickou sekvenci 5'UTR sestřihové varianty Var 14 glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII). K tomu byla použita metoda dvoukrokové PCA. Sekvence byla rozdělena do 8 překrývajících se oligonukleotidů a spojena do jedné dsDNA pomocí dvou po sobě jdoucích PCR. Produkt syntézy byl zaklonován do pomocného vektoru pUC19. Po jeho osekvenování byly opraveny nalezené mutace. Produkt byl subklonován do cílového vektoru pcDNA4 His Var 14 již obsahujícího sekvenci vlastního genu GCPII. Tento konstrukt byl následně použit k sestrojení kalibrační křivky, která bude i nadále sloužit jako standard pro RT-PCR pro zjištění kvantity této varianty GCP II u pacientů s rakovinou prostaty. Konstrukt bude také používán jako expresní vektor pro produkci Var 14 varianty GCPII v eukaryontním baculovirovém expresním systému. Klíčová slova: 5'UTR, dvoukroková PCA, pUC19, RT-PCR, GCPII
|
|
|
Příprava expresního systému gama-laktamázy a otestování exprese v E.coli
Magyerková, Monika ; Ingr, Marek (vedoucí práce) ; Šácha, Pavel (oponent)
γ-laktamasa je enzym štěpící pětičlenné laktamové cykly. Jedním z jejích potenciálních substrátů je polyvinylpyrrolidon (PVP). Degradace PVP γ-laktamasou je zkoumána s ohledem na využití v čistírnách odpadních vod. Cílem této práce proto bylo připravit synteticky gen γ- laktamasy z bakterie Comamonas acidovorans a provést jeho klonování do expresního vektoru pET22b. Pro syntézu genu γ-laktamasy byla použita metoda PCA. Sekvence genu γ- laktamasy o délce 1725 bp byla rozdělena do dvou částí (syntonů), které byly syntetizovány samostatně. Po syntéze bylo provedno restrikční štěpení a ligace do vektoru pUC19. Takto připravenými konstrukty byly transformovány kompetentní buňky E. coli kmene DH5α. Po ověření správnosti sekvencí byly oba syntony vyštěpeny restrikčními endonukleasami a spojeny jednokrokovou ligací do plazmidu pET22b. Rekombinantním plazmidem obsahujícím spojené syntony byly transformovány expresní buňky E. coli kmene BL21(DE3)RIL a byla testována exprese rekombinantní γ-laktamasy. Sekvence klonu produkujícío protein odpovídající délky byla potvrzena sekvenční analýzou. Připravený expresní plazmid bude použit pro produkci rekombinantní γ-laktamasy. (In Czech)
|
|
| |
|
|
Strukturní biologie komplexu potkaních NK buněčných receptorů NKR-P1B a Clrb
Dvorská, Anna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
NK buňky mají důležitou roli v nespecifické imunitě organismů. Jejich schopností je rozpo- znat a zabít nádorové a virově infikované buňky bez předchozí senzitizace antigenem. Jejich funkce je usměrňována množstvím stimulačních a inhibičních receptorů interagujících s li- gandy na cílové - nádorové či infikované buňce. Tato práce se zabývá přípravou a studiem komplexu potkaního NK buněčného inhibičního receptoru NKR-P1B ("natural killer cell re- ceptor - protein 1B") a jeho ligandu Clrb ("C-type lectin-related ligand b"). Clrb spouští inhibici NKR-P1B, což znamená, že pokud buňka exprimuje Clrb, nebude zničena. Při in- fekci potkaním cytomegalovirem ztrácí buňka ze svého povrchu Clrb a není tedy zabráněno jejímu zničení. Buňky infikované tímto virem se brání zničení pomocí exprese virového genu C-lektinového typu RCTL, jenž je homologem Clrb. Pro rekombinantní přípravu rozpustné formy těchto dvou receptorů potkaních NK bu- něk byla použita tranzientní transfekce linie lidských embryonálních ledvinných buněk 293 s jednoduchou glykosylací (HEK293S GnTI− ). Nativní formy receptorů - disulfidicky vázané homodimery - byly připraveny jako fúzní konstrukty s IgG Fc (s pomocí vektoru pYD5), které po odštěpení TEV proteasou poskytují čistě dimerní formu extracelulární části re- ceptorů bez jakékoliv afinitní...
|
|
| |
|
|
Heterologní exprese lidské NADPH:cytochrom P450 reduktasy
Mazurová, Martina ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
Se studiem karcinogenese přímo souvisí studium metabolismu xenobiotik, neboť ta se mohou na vzniku rakoviny podílet. Systém monooxygenas se smíšenou funkcí, který se na odbourávání cizorodých látek významně podílí, je v laboratoři, v níž byla práce prováděna, studován především pomocí experimentů in vitro. Pro získání potřebných rekombinantních enzymů se v současnosti hojně využívá metoda heterologní exprese. V této práci byla tato metoda použita pro přípravu lidské NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasy, membránového enzymu, který redukuje cytochrom P450 a tím umožňuje jeho katalytickou aktivitu. Byly připraveny a ověřeny vektory, nesoucí syntetický gen pro lidskou NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasu, založené na plasmidech pUC19 a pET22b. Reduktasa byla produkována v buňkách E. coli BL21-Gold a E. coli BL21-CodonPlus-RIL. Celková produkce proteinu v buňkách byla vysoká, problémem však bylo, že vznikající protein byl přítomen převážně v inkluzních tělískách. Byly částečně optimalizovány podmínky exprese tak, aby zvětšil podíl nativního proteinu v bakteriální membránové frakci.
|
|
|
Příprava lidského NK buněčného aktivačního receptoru NKp80 a jeho ligandu AICL
Kalousková, Barbora ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
NK buňky (z angl. natural killer cells, přirozeně zabíječské buňky) hrají klíčovou roli při rozpoznávání a ničení nádorových, infikovaných nebo jinak pozměněných buněk. Na svém povrchu nemají antigenně specifické receptory, proto je řadíme mezi složky přirozené imunity. K rozpoznání cílových buněk slouží řada jiných povrchových receptorů. Inhibiční receptory zajišťují buněčnou toleranci, naopak aktivační receptory spouští cytotoxické mechanismy vedoucí k apoptóze a tedy lýzi buňky. Díky této vlastnosti jsou NK buňky intenzivně studovány v souvislosti s imunoterapií nádorových onemocnění. Jedním z aktivačních receptorů je NKp80 rozpoznávající svůj ligand AICL. Oba proteiny patří do rodiny receptorů podobných lektinům C-typu. Tento komplex se účastní nejenom přímé lýze maligních buněk myeloidního charakteru, ale má také důležitou roli v imunomodulaci zánětu. Předmětem této diplomové práce je příprava receptoru NKp80 a jeho ligandu AICL. Receptor NKp80 byl připraven v linii lidských embryonálních ledvinných buněk (HEK 293S GnTI- ). Byly připraveny stabilně transfekované linie produkující protein NKp80 konstitutivně nebo indukovatelně. Zapojení disulfidických můstků a obsazení N-glykosylačních míst proteinu NKp80 bylo ověřeno hmotnostní spektrometrií. Dále byl optimalizován postup Mgr. Jiřího Nového na...
|
|
|
Strukturní biologie komplexu potkaních NK buněčných receptorů NKR-P1B a Clrb
Dvorská, Anna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
NK buňky mají důležitou roli v nespecifické imunitě organismů. Jejich schopností je rozpo- znat a zabít nádorové a virově infikované buňky bez předchozí senzitizace antigenem. Jejich funkce je usměrňována množstvím stimulačních a inhibičních receptorů interagujících s li- gandy na cílové - nádorové či infikované buňce. Tato práce se zabývá přípravou a studiem komplexu potkaního NK buněčného inhibičního receptoru NKR-P1B ("natural killer cell re- ceptor - protein 1B") a jeho ligandu Clrb ("C-type lectin-related ligand b"). Clrb spouští inhibici NKR-P1B, což znamená, že pokud buňka exprimuje Clrb, nebude zničena. Při in- fekci potkaním cytomegalovirem ztrácí buňka ze svého povrchu Clrb a není tedy zabráněno jejímu zničení. Buňky infikované tímto virem se brání zničení pomocí exprese virového genu C-lektinového typu RCTL, jenž je homologem Clrb. Pro rekombinantní přípravu rozpustné formy těchto dvou receptorů potkaních NK bu- něk byla použita tranzientní transfekce linie lidských embryonálních ledvinných buněk 293 s jednoduchou glykosylací (HEK293S GnTI− ). Nativní formy receptorů - disulfidicky vázané homodimery - byly připraveny jako fúzní konstrukty s IgG Fc (s pomocí vektoru pYD5), které po odštěpení TEV proteasou poskytují čistě dimerní formu extracelulární části re- ceptorů bez jakékoliv afinitní...
|
|
|
Study of the cleavage kinetics of Gag polyprotein from HIV-1 virus by the viral proteinase
Krištofičová, Ivica ; Ingr, Marek (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
Polyprotein Gag je prekurzorem strukturních proteinů viru HIV-1 nezbytných pro správné složení, pučení a zrání virové částice v průběhu životního cyklu viru HIV-1. Proces zrání do stádia infekčního virionu je závislý na štěpení polyproteinu Gag a GagPol virovou proteinasou na devíti přesně určených místech. Narušení tohoto štěpení je jedním z hlavních terapeutických cílů v léčbě nákazy HIV. Virus HIV-1 si však vytváří rezistenci k inhibitorům proteinasy vznikem mutací jak v proteinase samotné, tak v jejím substrátu. Štěpení Gagu HIV-1 proteinasou je proces s přesně daným pořadím a rychlostí jednotlivých kroků. Předchozí biochemické studie stanovily kinetické parametry těchto procesů s pomocí oligopeptidů reprezentujících přirozeně se vyskytující štěpicí místa. Tato práce popisuje štěpení samotného polyproteinu Gag, který je přirozeným substrátem HIV-1 proteinasy. Za tímto účelem byl rekombinantně připraven kompletní polyprotein Gag v bakteriálním expresním systému. Bylo provedeno jeho štěpení HIV-1 proteinasou a produkty tohoto štěpení byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a Western blotu. Dále byla porovnána substrátová specifita proteinasy divokého typu a mutované varianty HIV-1 proteinasy vůči kompletnímu divokému typu Gag polyproteinu. Byly pozorovány podstatné rozdíly mezi rychlostmi jednotlivých kroků...
|
host ::
RSS.