|
| |
|
|
Regulation of transcription by proteins of the Early growth response and Myb families
Čermák, Vladimír ; Dvořák, Michal (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent) ; Elleder, Daniel (oponent)
Regulace transckripce desítek tisíc genů v organizmu obratlovců je mimořádně komplexním fenoménem, jehož se účastní tisíce různých regulačních proteinů. Největší funkční kategorií těchto regulátorů jsou sekvenčně specifické DNA vazebné proteiny známé jako transkripční faktory. Proteiny z EGR a Myb rodin transkripčních faktorů jsou relativně dlouho zkoumanými regulátory různých fyziologických procesů, včetně buněčné proliferace a diferenciace. Zatímco strukturální a fyzikální aspekty jejich funkce byly dobře charakterizovány, jejich buněčně specifická role v komplexních genově regulačních sítích není dostatečně prostudována a představuje hlavní výzvu v příslušných oblastech výzkumu. Předběžná analýza dat genové exprese z metastázujících buněk PR9692 a nemetastázujících buněk PR9692-E9 (kuřecích sarkomové linie) odhalila, že transkripční faktor EGR1 je syntetizován v relativně větším množství v metastázujících buňkách a může se tak podílet na regulačních procesech, které jsou základem rozdílů mezi oběma buněčnými liniemi. Dalším zkoumáním jsme zjistili, že cílené zvýšení hladiny EGR1 v PR9692-E9 buňkách obnovuje jejich metastatický potenciál na úroveň PR9692 buněk. Mikročipová analýza takových buněk odhalila aktivaci genů, které jsou rozhodující pro kontraktilitu aktinového cytoskeletu (MYL9),...
|
|
|
Úloha signální kaskády ERK v regulaci aktinového cytoskeletu a morfologických změn epiteliálních buněk
Rasl, Jan ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Tolde, Ondřej (oponent)
Signální kaskáda ERK patří mezi základní signální dráhy eukaryotických buněk, která reaguje na široké spektrum podnětů a následně se podílí na vytvoření konkrétní odpovědi. Ukazuje se, že signální kaskáda ERK indukuje rozpad architektury epitelu a indukuje morfologické změny vedoucí k zisku autonomie epiteliálních buněk. Během rozvolnění epiteliální struktury se signální kaskáda ERK účastní remodelace aktinového cytoskeletu, což má za následek ztrátu epiteliální polarity, rozvolnění mezibuněčných spojů a následně spuštění migračního programu, který umožňuje epiteliálním buňkám využít mezenchymálního způsobu migrace. Jednou z nejméně prozkoumaných aktinových struktur epiteliálních buněk je tzv. periferní aktin, kontraktilní aktinová struktura, která obemyká kolonie epiteliálních buněk. Periferní aktin se nachází na bazální straně buněk a pravděpodobně se podílí na udržení integrity epitelu. Nicméně dodnes není známo, jestli, a popřípadě jakým způsobem, se signální kaskáda ERK účastní na regulaci periferního aktinu a jestli remodelace periferního aktinu hraje roli v buněčné migraci. V této práci ukazujeme, že signální kaskáda ERK je důležitá pro remodelaci periferního aktinu. Akivace signální kaskády ERK vede k rozrušení této aktinové struktury a jejího nahrazení dendritickým aktinem lamellipodia a...
|
|
|
Analyzing the role of the p130Cas SH3 domain in p130Cas-mediated signaling
Gemperle, Jakub ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
IN CZECH Adaptorový protein p130Cas (CAS, BCAR1) propojuje signalizaci od integrinových receptorů s receptory růstových faktorů a ovlivňuje správný embryonální vývoj a tkáňovou homeostázu. Jeho změněná exprese může vyvolat mnoho patologických stavů, včetně nádorového bujení, metastazování a rezistence vůči různým protinádorovým lékům. Molekulární mechanismy, jakými p130Cas přispívá k různým patologickým stavům nejsou zatím jednoznačně popsány. Cílem mé doktorské práce bylo tedy poskytnout nové poznatky o signalizaci p130Cas a o její regulaci. Doména SH3 je nepostradatelná pro signalizaci proteinu p130Cas, ale její vazebné preference/regulace nebyly dosud přesně charakterizovány ani strukturně popsány. Proto jsme začali spolupracovat se skupinou Dr. Veverky (Strukturní biologie) a Dr. Lepšíkem (Výpočetní biochemie, AV ČR). S jejich pomocí jsme pak připravili fúzní chiméry SH3 domény proteinu p130Cas se svými ligandy a provedli strukturní analýzu NMR, která nám pomohla strukturně popsat atypický vazebný motiv SH3 domény proteinu p130Cas. Díky této spolupráci jsem se navíc naučil, jak tyto struktury vizualizovat a analyzovat. Tato práce rozšířila naše znalosti o regulaci vazby mezi p130Cas SH3 a jejími ligandy a dále vedla k vylepšenému modelu vazby mezi Src-p130Cas-FAK. Naše snaha sledovat aktivitu...
|
|
|
Molecular mechanism of quality control during snRNP biogenesis
Klimešová, Klára ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Sestřihový komplex patří mezi největší a nejdynamičtější molekulární mašinérie v buňce. Hlavní část komplexu je tvořena pěti malými jadernými ribonukleoproteinovými částicemi (zkráceně snRNP). Ty vznikají složitým procesem, který je rozdělen do několika kroků. SnRNP částice jsou navíc během sestřihu výrazně přestavěny a po každé sestřihové reakci proto musí dojít k jejich regeneraci. Jak skládání nových snRNP, tak recyklaci post-sestřihových částic řídí a usnadňují specializované chaperony. V této práci jsem se zaměřila na dva chaperony snRNP částic, SART3 a TSSC4, a odhalila molekulární detaily jejich funkce. Zatímco TSSC4 nebyl dříve charakterizován, SART3 byl popsán jako faktor specifický pro U6 snRNP, který napomáhá sloučení U6 a U4 částic do di-snRNP komplexu a je důležitý pro recyklaci použitých U4/U6 snRNP. Mechanismus, kterým funguje, byl však nejasný. V této práci přináším důkaz, že SART3 interaguje s post-sestřihovým komplexem a navrhuji, že by se SART3 mohl podílet na jeho rozpadu. Naše data dále naznačují, že se SART3 váže na U6 snRNP už v rámci post-sestřihového komplexu a koordinuje tak celou recyklační fázi U6 částice. Dále zde ukazuji, že TSSC4 je nový chaperon specifický pro U5 snRNP a že napomáhá U5 a U4/U6 částicím, aby se složily do finálního tri-snRNP komplexu. Identifikovali...
|
|
|
Mechanisms of phenotypic plasticity induced by genotoxic stress
Přibyl, Miroslav ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Remešová, Hana (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Rezistence nádorových buněk vůči léčbě představuje hlavní důvod neúspěšné nádorové terapie. Růst nádorových buněk v primárním místě nádoru nebo jejich šíření a růst v sekundárních oblastech jsou hlavní důvody, proč pacienti nemoci podlehnou. I moderní terapie založené na aktivaci imunitního systému nachází své hranice u mnohých typů nádorů. Rezistence vůči léčbě je zprostředkována nejen nádorovými buňkami, ale i jinými komponenty nádorového mikroprostředí. Porozumění mechanizmům nádorové rezistence zprostředkované nádorovými buňkami, ale i nádorovému mikroprostředí umožní vývoj nových terapeutických přístupů. V této práci představujeme naše nedávné výsledky. Ozařování, 5-azacytidin i IFNγ indukují expresi genu suprabasin (SBSN) a vznik fenotypu nádorových buněk, který je zodpovědný za resistenci vůči terapii a projevuje se nízkou adhezivitou a kmenovými vlastnostmi nádorových buněk. Snížení exprese genu SBSN vedlo k potlačení tohoto fenotypu. Rovněž jsme identifikovali aberantně zvýšenou expresi genu SBSN v kostní dřeni podskupiny pacientů trpících myelodysplastickými syndromy (MDS). Exprese SBSN byla zprostředkována supresorovými buňkami odvozenými z myeloidní řady (MDSCs) a hladina SBSN negativně korelovala se zastoupením T buněk a koncentrací CCL2 v kostní dřeni pacientů. Z toho vychází možný...
|
|
|
Quality control in snRNP biogenesis
Roithová, Adriana ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Malínský, Jan (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
v češtině snRNP patří k nejdůležitějším částem sestřihového komplexu. Jejich životní cyklus se odehrává v cytoplasmě, kde probíhají první fáze jejich biogeneze, a také v jádře, kde plní svoji hlavní funkci. Všechny snRNP jsou složeny z krátké nekódující RNA, z Sm či LSm proteinů tvořící 7-členný kruh a z proteinů specifických pro každý snRNP. Jejich životní cyklus začíná v jádře, kde jsou transkribovány RNA polymerázou II nebo III. Poté jsou transportovány do cytoplasmy. Během své cytoplasmatické fáze se formuje Sm kruh kolem specifické sekvence na RNA pomocí SMN komplexu a následně se trimetyluje čepička na 5'konci snRNA. Tyto 2 úpravy jsou signálem, že je snRNP připravena na transport do jádra, kde je hromaděna v jaderných strukturách nazývající se Cajalova tělíska. V Cajalových tělískách probíhá finální část jejich zrání. Průběh snRNP biogeneze je průběžně kontrolován. První kontrola probíhá v jádře ihned po jejich transkripci a následuje vytvoření exportního komplexu. Druhý kontrolní bod je v cytoplasmě a zahrnuje tvorbu Sm kruhu. Víme, že Sm kruh je tvořen SMN komplexem ale detailní mechanismus je stále neznámý. Pokud snRNA neprojde těmito kontrolními body, tak je v cytoplasmě degradována. Avšak, jak buňka rozlišuje mezi normálními a defektními snRNA se stále neví. Třetí a poslední kontrolní...
|
|
|
Mechanism of regulation of EGFR receptor ligand activation via the intramembrane pseudoprotease iRhom and cell surface metalloprotease ADAM17
Trávníčková, Květa ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Signalisace skrz receptor pro epidermální růstový faktor (EGF receptor, EGFR) podléhá propracované a mnohovrstevné regulaci. Jedním ze způsobů vylaďování signalisace zprostředkované tímto receptorem je kontrola produkce jeho ligandů. U savců za uvolňování solubilních, biologicky aktivních forem ligandů EGF receptoru zodpovídají především metaloproteasy ADAM10 a ADAM17. Pseudoprotease iRhom z rodiny rhomboid-like proteinů byla nedávno připsána úloha klíčového positivního regulátora ADAM17. U drosofily však je iRhom spjat s negativní regulací EGF receptoru, a to prostřednictvím degradace prekursorů jeho ligandů. Experimenty prováděné v savčích buněčných kulturách ovšem naznačují, že podobná funkce by mohla být zachována i u savčích iRhomů. V této diplomové práci byl studován vliv overexprese iRhomu na expresní úroveň ligandů EGF receptoru. Na rozdíl od dřívějších publikací však nebylo potvrzeno, že by pozorovaný efekt bylo možno vysvětlit výlučně přítomností iRhomu, neboť neaktivní mutanti rhomboidních proteas jej působili rovněž. Také nebylo prokázáno, že by iRhom takto ovlivňoval pouze ligandy EGF receptoru - strukturně podobné, avšak ligandům EGF receptoru nepříbuzné proteiny v přítomnosti iRhomu taktéž podléhaly depleci. Koexprese ADAM17 mizení ligandů EGF receptoru zamezila, avšak pouze v...
|
|
|
Regulation of Epithelial-Mesenchymal transition by the ERK pathway.
Čáslavský, Josef ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent) ; Gregor, Martin (oponent)
Epiteliální tkáň se skládá z uniformních, polarizovaných buněk, které jsou mezi sebou propojeny řadou kohezivních kontaktů napojených na aktinový cytoskelet. Přestože na první pohled epitel působí jako pevná a neměnná struktura, během různých fyziologických a patofyziologických dějů zahrnujících embryonální vývoj či rozvoj nádorů, může epiteliální tkáň výrazně měnit své charakteristické rysy. V těchto dějích epiteliální buňky mohou podstupovat nejrůznější morfologické změny, které zahrnují ztrátu polarity, rozrušení mezibuněčných spojení a iniciaci individuální buněčné migrace. Tyto změny v morfologii jsou souhrnně označované jako epitelo-mesenchymální tranzice a umožnují buňkám efektivně prostupovat do okolních tkání. Předpokládá se, že jsou hlavním faktorem umožnující šíření nádorových buněk. Signální dráha ERK, která se skládá se ze tří sekvenčně aktivovaných proteinkináz RAF, MEK a ERK, hraje důležitou úlohu v přeměně epitelialní tkáně na individuálně migrující buňky. Důležitou efektorovou proteinkinázou v rámci zmíněné signální dráhy je kináza ERK. ERK fosforyluje celou řadu proteinů jak v cytoplazmě, tak i v jádře a jejich fosforylace následně řídí různé buněčné odpovědi. Otázkou zůstává, jakým způsobem signální dráha ERK řídí transformaci epiteliálních buněk na individuálně migrující buňky....
|
|
|
Identification of novel substrates of PKN3 kinase and characterization of the role of phosphorylation in the regulation of Rho GAP activity
Dibus, Michal ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent) ; Petrák, Jiří (oponent)
Proteínová fosforylácia predstavuje jednu z najdôležitejších posttranslačných modifikácií v signálnom prenose a zohráva kľúčovú úlohu v regulácii väčšiny bunkových procesov, vrátane bunkového cyklu, komunikácie s extracelulárnym prostredím, bunkovej migrácie, alebo apoptózy. Fosforylácia je sprostredkovaná kinázami, deregulácia ktorých často negatívne ovplyvňuje vývoj a celkovú homeostázu a vedie k vzniku viacerých druhov ochorení, vrátane rakoviny. V tejto práci sme sa zamerali na identifikáciu nových substrátov kinázy PKN3, ktorá je známym regulátorom organizácie cytoskeletu a pro-malígneho rastu nádorov. Za použitia analóg-senzitívnej mutácie PKN3 sme urobili fosfoproteomický screen a identifikovali sme 281 proteínov, ktoré by potenciálne mohli byť fosforylované kinázou PKN3. Spomedzi týchto proteínov sme pre ďalší výskum vybrali ARHGAP18 z rodiny Rho GAP proteínov. Potvrdili sme, že PKN3 je schopná fosforylovať ARHGAP18 na Thr154, Ser156 a Thr158, a že tieto proteíny sú schopné vzájomnej interakcie v závislosti na izoforme ARHGAP18. Ďalej sme ukázali, že zámena týchto troch miest za fosfomimikujúci aspartát viedla k aktivácii GAP domény ARHGAP18, výsledkom čoho došlo k zníženiu hladiny aktívneho RhoA naznačujúc možnú existenciu negatívnej spätnej väzby v regulácii RhoA signalizácie. V druhej...
|
host ::
RSS.