|
|
Structural studies of metal-dependent hydrolases: Histone Deacetylase 6 and Glutamate Carboxypeptidase II
Shukla, Shivam ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Stříšovský, Kvido (oponent) ; Kolenko, Petr (oponent)
Hydrolasy závislé na zinku patří do třídy metaloenzymů, které obsahují zinečnaté kationty katalyzující hydrolytické reakce. Strukturní studie těchto enzymů jsou prováděny za účelem získání detailních informací o povaze jejich trojrozměrné struktury, organizaci domén a štěpení jejich přirozených substrátů. Tato práce popisuje strukturní charakteristiku dvou různých metalohydrolas 1) lidské histondeacetylasy 6 (HDAC6) a 2) glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) s využitím odlišné sady biofyzikálních technik. HDAC6 je strukturně unikátní vícedoménový enzym složený z nestrukturovaných a globulárních domén. Reguluje množství buněčných procesů odštěpováním acetylové skupiny z postranních řetězců lysinů vyskytujících se v cílových proteinech. Je známo, že HDAC6 deacetyluje substráty odlišné od histonů jako je tubulin, Hsp90, cortactin a peroxiredoxiny. Vzhledem k jeho strukturní komplexnosti jsou dostupné strukturní informace o HDAC6 omezeny pouze na jeho globulární domény. V této studii byl použit komplexní metodický přístup založený na integraci experimentálních dat získaných několika ortogonálními biofyzikálními technikami, který umožnil tvorbu strukturního modelu HDAC6 v roztoku. Získaný model ukazuje, že díky svým nestrukturovaným oblastem HDAC6 může zaujímat více konformací a v roztoku se pravděpodobně...
|
|
|
Inhibitors of rhomboid proteases as tools for cell biology
Kuzmík, Ján ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Rhomboidní proteázy jsou intramembránové serinové proteázy. Původně byly objeveny jako proteiny důležité pro zárodečný vývoj Drosophily melanogaster, dnes je však známo, že se nachází napříč všemi skupinami organismů a jsou spojovány s řadou významných onemocnění a patogenů. Příkladem je malárie, úplavice, Parkinsonovo onemocnění, řada typů rakoviny či diabetes. Avšak u řady rhomboidních proteáz dosud neznáme jejich přirozené substráty, a tedy ani jejich funkce není často objasněna na molekulární úrovni. Vývoj jejich specifických inhibitorů je důležitý jednak pro jejich využití jako nástrojů buněčné biologie k objasnění role rhomboidních proteáz, ale také pro jejich potenciální využití ve farmakoterapii. Doposud známé inhibitory rhomboidních proteáz jsou charakteristické elektrofilním centrem, které cílí na nukleofilní serin v rámci neobvyklé serin-histidinové katalytické dyády rhomboidů. Zatím největší potenciál vykazují inhibitory v podobě peptidyl -ketoamidů s různými substituenty vázanými na dusík ketoamidové skupiny, které byly dříve vyvinuty v naší laboratoři. Jsou velmi účinné, reverzibilní, selektivní a laditelné. Jejich výhodou je také to, že využívají elektrofilní ketoamidovou skupinu, která je součástí i některých již schválených léčiv. Cílem mé práce bylo pokusit se dále zvýšit účinnost těchto...
|
|
|
Proximity proteome of intramembrane serine protease RHBDL4
Boháčová, Šárka ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent)
Intramembránová proteolýza je součástí celé řady buněčných drah a procesů. Je katalyzována specializovanými enzymy - intramembránovými proteázami (IMPR), které svůj substrát štěpí v rámci jeho transmembránové domény pod povrchem membrány. Rhomboidní proteázy jsou serinové IMPR. Vyskytují se napříč celým spektrem živých organismů a co do transmembránové topologie a sekvenčních motivů jsou evolučně konzervovány. Avšak navzdory dlouhodobé snaze, fyziologickou úlohu většiny rhomboidních proteáz doposud neznáme. RHBDL4 je savčí rhomboidní proteáza nacházející se v endoplasmatickém retikulu. Podílí se na vzniku kolorektálního karcinomu, což podtrhuje význam jejího studia. Fyziologická úloha RHBDL4 je však převážně neobjasněna. Za účelem jejího hlubšího prozkoumání jsem zavedla a následně aplikovala metodu proximitní proteomiky označovanou APEX2. Je založena na značení proteinů v blízkosti vybraného cíle biotinem, a to ve fyziologickém prostředí živých neporušených buněk. Značené proteiny jsou následně izolovány a detekovány pomocí hmotnostní spektrometrie. Analýzou proximitního proteomu proteázy RHBDL4 je možné odhalit její interakční partnery, substráty či lépe definovat konkrétní podoblast ER, kde se vyskytuje. V rámci tří nezávislých experimentů v buněčné linii HCT116 se tři proteiny opakovaně...
|
|
|
Development of inhibitors of rhomboid proteases as tools for the study of their biological functions
Tichá, Anežka ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Šedo, Aleksi (oponent) ; Konvalinka, Jan (oponent)
Rhomboidy jsou serinové membránové proteasy, které patří do evolučně rozšířené rodiny rhomboidních proteinů. Rhomboidy si ve srovnání s klasickými serinovými proteasami vyvinuly odlišný katalytický mechanismus; místo běžně triády (Ser/His/Asp) k proteolýze využívají pouze katalytickou dyádu (Ser/His) a jejich aktivní místo se nachází uvnitř lipidové membrány, což - společně s faktem, že jsou hydrofobní - komplikuje jejich studium. Přestože je známé jejich zapojení v mnoha důležitých biologických procesech, stále u většiny rhomboidů není jasný konkrétní mechanismus, kterým přispívají k regulaci těchto procesů nebo k patologickým projevům souvisejících onemocnění (jako např. malárie, Parkinsonova choroba nebo rakovina). Pochopení těchto dějů je ztíženo nedostatkem nástrojů k jejich studiu jak in vitro, tak in vivo. Ve své práci uvádím nové fluorogenní substráty založené na Försterově rezonančním přenosu energie (FRET) a odvozené od sekvence LacYTM2, které umožňují široké využití pro kontinuální sledování aktivity mnoha rhomboidů in vitro. Modifikacemi v P5-P1 pozicích je možné zvýšit specifitu substrátu k cílovému rhomboidu, zatímco výběr FRET páru fluoroforů absorbujícího v červené oblasti viditelného světla umožňuje jejich využití pro rychlé testování knihoven molekul. Selektivní a účinné...
|
|
|
Mechanism of regulation of EGFR receptor ligand activation via the intramembrane pseudoprotease iRhom and cell surface metalloprotease ADAM17
Trávníčková, Květa ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Signalisace skrz receptor pro epidermální růstový faktor (EGF receptor, EGFR) podléhá propracované a mnohovrstevné regulaci. Jedním ze způsobů vylaďování signalisace zprostředkované tímto receptorem je kontrola produkce jeho ligandů. U savců za uvolňování solubilních, biologicky aktivních forem ligandů EGF receptoru zodpovídají především metaloproteasy ADAM10 a ADAM17. Pseudoprotease iRhom z rodiny rhomboid-like proteinů byla nedávno připsána úloha klíčového positivního regulátora ADAM17. U drosofily však je iRhom spjat s negativní regulací EGF receptoru, a to prostřednictvím degradace prekursorů jeho ligandů. Experimenty prováděné v savčích buněčných kulturách ovšem naznačují, že podobná funkce by mohla být zachována i u savčích iRhomů. V této diplomové práci byl studován vliv overexprese iRhomu na expresní úroveň ligandů EGF receptoru. Na rozdíl od dřívějších publikací však nebylo potvrzeno, že by pozorovaný efekt bylo možno vysvětlit výlučně přítomností iRhomu, neboť neaktivní mutanti rhomboidních proteas jej působili rovněž. Také nebylo prokázáno, že by iRhom takto ovlivňoval pouze ligandy EGF receptoru - strukturně podobné, avšak ligandům EGF receptoru nepříbuzné proteiny v přítomnosti iRhomu taktéž podléhaly depleci. Koexprese ADAM17 mizení ligandů EGF receptoru zamezila, avšak pouze v...
|
|
|
Substrate specificity, mechanism and activity regulation of the rhomboid family intramembrane proteases
Škerle, Jan ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Hof, Martin (oponent) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
Intramembránové proteasy z rodiny rhomboidů jsou v přírodě široce rozšířeny a vyskytují se ve všech doménách života. Podílejí se na mnoha důležitých procesech, jako například kontrola kvality membránových proteinů nebo mitochondriální dynamika. Jejich aktivita souvisí s nemocemi jako Parkinsonova nemoc nebo rakovina. Proto se rhomboidy jeví jako potenciální terapeutické cíle. V této práci jsme se snažili objasnit detailní mechanismus fungování modelové proteasy GlpG z E. coli. Zaměřili jsme se i na mechanismus rhomboidu RHBDL2, což je jeden ze čtyř eukaryotických rhomboidů, jejichž funkce není příliš prostudována. Pro pochopení vazby mezi substrátem a enzymem jsme připravili řadu nových peptidyl-chlormethylketonových inhibitorů odvozených od proteinu TatA, což je substrát rhomboidu v P. stuartii. Díky krystalové struktuře komplexů GlpG s těmito inhibitory jsme prozkoumali vazebná místa substrátu S1 až S4, což nám umožnilo objasnit strukturní podstatu substrátové specifity enzymu. Ukázali jsme, že rychlost štěpení substrátu může být významně ovlivněna modifikací sekvence substrátu na pozicích P1 až P5. Na základě těchto pozorování jsme vyvinuli fluorogenní transmembránový peptidový substrát rhomboidových proteas, který je použitelný jak v detergentu, tak v liposomech, a je vhodný pro testování s...
|
|
|
The role of ADAM17 and other metalloproteases in liver pathological processes
Žbodáková, Oľga ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Muchová, Lucie (oponent) ; Stříšovský, Kvido (oponent)
2 Abstrakt Jaterní fibróza je patologický stav, při kterém dochází ke zmnožení vaziva v jaterní tkáni. V pokročilém stádiu vede k cirhóze nebo až k hepatocelulárnímu karcinomu. Tento jev se vyskytuje u všech chronických jaterních onemocnění a jeho prevalence u dospělé populace v Evropě se odhaduje okolo 4 %. V této práci jsem se zabývala rolí tří metaloproteáz z rodiny metzincinů - ADAM17, ADAM10 a MMP-19, v jaterní fibróze a regeneraci jater. Proteázy ADAM17 a ADAM10 jsou významné při regulaci signálních drah ovlivňujících imunitní odpověď a buněčnou diferenciaci. Obě proteázy odštěpují z buněčných membrán ektodomény svých substrátů, čímž mohou regulovat dostupnost ligandů nebo funkčnost receptorů. Mnoho z těchto substrátů hraje roli v jaterních patologiích. MMP19 je naproti tomu metaloproteázou, jež hraje důležitou úlohu při štěpení extracelulární matrix, což je proces významný jak při rozvoji, tak při hojení fibrózy. Naše výsledky prokázaly, že inaktivace ADAM10 vede u myších modelů ke zvýšené náchylnosti k tvorbě spontánní i toxinem indukované jaterní fibrózy. Myší modely deficientní pro ADAM10 vykazovaly poškození epitelu žlučových kanálků, charakterizované zvýšením negativních biliárních markerů v séru těchto zvířat. Oproti tomu inhibice ADAM17 měla protektivní účinek v experimentálních modelech, jež...
|
|
|
Protein quality control in the secretory pathway of eukaryotic cells
Bařinková, Markéta ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Více než 30 % buněčného proteomu vstupuje během biogeneze do sekreční dráhy v eukaryotických buňkách. Sekreční dráha pak zajišťuje, že jsou tyto proteiny správně složeny, projdou nutnými posttranslačními úpravami a jsou dopraveny ke svému cílovému umístění ať už v membránových organelách, nebo vně buňky. Protože ale značné množství proteinů vstupujících do této dráhy je nefunkční, nebo se nefunkční stane, musí buňka disponovat mechanismy pro kontrolu kvality proteinů, pomocí kterých je z buňky odstraňuje. Jak proteiny putují sekreční dráhou, mohou být degradovány několika způsoby jak v endoplasmatickém retikulu, tak v Golgiho aparátu, endosomech nebo na plasmatické membráně. V těchto drahách je využíváno mnoho molekul od chaperonů, přes ubikvitin ligázy a mnoho dalších. Jsou spojeny sjednocujícím principem, který se nazývá "unfolded protein response" (reakce na nesložené proteiny). Ten tyto dráhy podporuje, pokud jsou přehlcené. Studium mechanismů kontroly kvality proteinů je nutností, neboť nám pomáhá osvětlit vznik značného množství buněčného proteomu. Poruchy v této dráze jsou navíc spojeny s řadou lidských onemocnění od cystické fibrózy po některé neurodegenerativní poruchy. Tyto degradační dráhy jsou zkoumány již několik desetiletí, ale díky posunům v technologii se stále vynořují nové...
|
|
|
Rhomboid family intramembrane proteases in prokaryotes: mechanism, substrate repertoires and biological functions in the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis.
Began, Jakub ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
(Czech) Proteázy z rodiny rhomboidů patří do rozsáhlé skupiny serinových intramembránových proteáz, které katalyzují proteolytické štěpení membránových proteinů uvnitř jejich transmembránových oblastí, v hydrofobním prostředí lipidických buněčných membrán. Rhomboidové proteázy byly objeveny v roce 2001 v Drosophila. V průkopnické studii (Lee et al.) byla identifikována zásadní role Rhomboidu-1 (Rhom-1), který v rané fázi vývoje oka octomilky aktivuje signální dráhu receptoru epidermálního růstového faktoru. Rhomboidové proteázy, ať už aktivní proteázy (rhomboidy) či jejich katalyticky neaktivní protějšky (rhomboidové proteiny zahrnující iRhomy a Derliny), jsou silně konzervovány, což naznačuje jejich biologickou významnost. Rhomboidy jsou přítomné napříč živočišnými říšemi, od archea po člověka, zatímco proteolyticky neaktivní rhomboidové proteiny jsou přítomné výlučně v eukaryotních organizmech. Rodina rhomboidových proteinů hraje roli v široké škále rozmanitých biologických procesů, jakými je signalizace ve vývoji metazoí, mitochondriální biogenezi kvasinek, invaze protozoálních parazitů do hostitelských buněk, kvalitativní kontrola proteinů v endoplazmatickém retikulu (ER), či bakteriální quorum sensing. Ze strukturního i mechanistického hlediska jsou rhomboidy nejprostudovanějšími z...
|
|
|
Inhibitors of rhomboid proteases as tools for cell biology
Kuzmík, Ján ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Rhomboidní proteázy jsou intramembránové serinové proteázy. Původně byly objeveny jako proteiny důležité pro zárodečný vývoj Drosophily melanogaster, dnes je však známo, že se nachází napříč všemi skupinami organismů a jsou spojovány s řadou významných onemocnění a patogenů. Příkladem je malárie, úplavice, Parkinsonovo onemocnění, řada typů rakoviny či diabetes. Avšak u řady rhomboidních proteáz dosud neznáme jejich přirozené substráty, a tedy ani jejich funkce není často objasněna na molekulární úrovni. Vývoj jejich specifických inhibitorů je důležitý jednak pro jejich využití jako nástrojů buněčné biologie k objasnění role rhomboidních proteáz, ale také pro jejich potenciální využití ve farmakoterapii. Doposud známé inhibitory rhomboidních proteáz jsou charakteristické elektrofilním centrem, které cílí na nukleofilní serin v rámci neobvyklé serin-histidinové katalytické dyády rhomboidů. Zatím největší potenciál vykazují inhibitory v podobě peptidyl -ketoamidů s různými substituenty vázanými na dusík ketoamidové skupiny, které byly dříve vyvinuty v naší laboratoři. Jsou velmi účinné, reverzibilní, selektivní a laditelné. Jejich výhodou je také to, že využívají elektrofilní ketoamidovou skupinu, která je součástí i některých již schválených léčiv. Cílem mé práce bylo pokusit se dále zvýšit účinnost těchto...
|
host ::
RSS.