|
|
Automatizovaný bioreaktor pro kultivaci živých buněk
Ukropcová, Iveta ; Tolde, Ondřej (oponent) ; Dostál, Zbyněk (vedoucí práce)
Řízení kultivačních podmínek při mikroskopování živých buněk rozšiřuje možnosti biologických experimentů a zlepšuje jejich výpovědní hodnotu. Aby změny podmínek byly kontrolované a reprodukovatelné, je nutné omezit množství potřebných úkonů vykonávaných uživatelem mikroskopu a nahradit je automatizovanými procedurami. Proto byl vytvořen koncept nového automatizovaného kultivační zařízení (bioreaktoru). Toto zařízení řídí výměnu média v~pozorovací komoře, zajišťuje cirkulaci a výměnu atmosféry a~kontroluje její složení. Bioreaktor je určen pro použití v Laboratoři experimentální biofotoniky. Tato laboratoř disponuje koherencí řízeným holografickým mikroskopem (CCHM), který využívá metody kvantitativního fázového zobrazování (QPI). Bioreaktor je proto přizpůsoben aktuálním požadavkům této laboratoře a jeho optické části vyhovují nárokům metody QPI. V textu jsou specifikovány kultivační podmínky živých buněk a jsou shrnuty možnosti, jak je lze během mikroskopování řídit. Dále jsou popsána vybraná komerčně dostupná zařízení a je zhodnocena jejich vhodnost pro použití v Laboratoři experimentální biofotoniky. Stěžejní část práce se věnuje návrhu, realizaci a testování nového bioreaktoru.
|
|
|
Cytoskeleton-membrane protein interaction network in sperm
Adamová, Zuzana ; Komrsková, Kateřina (vedoucí práce) ; Tolde, Ondřej (oponent)
Spermie podstupuje několik návazných maturačních procesů, aby mohlo dojít k oplození. Posledním z nich je akrozomální reakce, exocytóza akrozomu, váčku naplněného lytickými enzymy. Akrozomální reakce je zásadní nejen pro průnik spermie skrz vaječné obaly, ale i pro reorganizaci membránových struktur spermie, v rámci které jsou na povrch vystaveny proteiny zásadní pro oplození, zejména pro rozpoznání, vazbu a fúzi gamet. Jedním z těchto proteinů je CD46, který se v intaktních spermiích nachází v akrozomální membráně a po zahájení exocytózy relokuje do ekvatoriálního segmentu hlavičky spermie, kde dochází k prvotnímu kontaktu spermie s plazmatickou membránou vajíčka. Relokaci CD46 zamezuje inhibice aktinu, jehož reorganizace v hlavičce spermie hraje důležitou roli v akrozomální reakci, nicméně není zřejmé, jakým mechanismem CD46 a aktin interagují. V této práci byl studován ezrin, protein propojující membránové proteiny s aktinovým cytoskeletem, v kontextu CD46 a jeho relokace. Imunofluorescenční detekce ezrinu odhalila jeho kolokalizaci s CD46, která je narušena během akrozomální reakce. Přítomnost ezrinu v intaktních i akrozomálně zreagovaných spermiích byla potvrzena technikou western blot. Interakce CD46 a ezrinu byla detekována ko-imunoprecipitací. Na základě těchto zjištění navrhujeme, že...
|
|
| |
|
|
Úloha signální kaskády ERK v regulaci aktinového cytoskeletu a morfologických změn epiteliálních buněk
Rasl, Jan ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Tolde, Ondřej (oponent)
Signální kaskáda ERK patří mezi základní signální dráhy eukaryotických buněk, která reaguje na široké spektrum podnětů a následně se podílí na vytvoření konkrétní odpovědi. Ukazuje se, že signální kaskáda ERK indukuje rozpad architektury epitelu a indukuje morfologické změny vedoucí k zisku autonomie epiteliálních buněk. Během rozvolnění epiteliální struktury se signální kaskáda ERK účastní remodelace aktinového cytoskeletu, což má za následek ztrátu epiteliální polarity, rozvolnění mezibuněčných spojů a následně spuštění migračního programu, který umožňuje epiteliálním buňkám využít mezenchymálního způsobu migrace. Jednou z nejméně prozkoumaných aktinových struktur epiteliálních buněk je tzv. periferní aktin, kontraktilní aktinová struktura, která obemyká kolonie epiteliálních buněk. Periferní aktin se nachází na bazální straně buněk a pravděpodobně se podílí na udržení integrity epitelu. Nicméně dodnes není známo, jestli, a popřípadě jakým způsobem, se signální kaskáda ERK účastní na regulaci periferního aktinu a jestli remodelace periferního aktinu hraje roli v buněčné migraci. V této práci ukazujeme, že signální kaskáda ERK je důležitá pro remodelaci periferního aktinu. Akivace signální kaskády ERK vede k rozrušení této aktinové struktury a jejího nahrazení dendritickým aktinem lamellipodia a...
|
|
|
Mechanismy invazivity a transkripční regulace nádorových buněk
Tolde, Ondřej ; Folk, Petr (vedoucí práce) ; Kovář, Jan (oponent) ; Brdička, Tomáš (oponent)
Mechanismy invazivity a transkripční regulace nádorových buněk Nádorové onemocnění má svůj původ v normálních tělních buňkách, které se vymknuly kontrole mateřského organismu. Nádorové buňky se pak mohou uvolnit z místa svého vzniku a šířit se po organismu. Pro průchod mezibuněčnou hmotou nebo vrstvou jiných buněk mohou tyto buňky využít mechanismy, které vedou k efektivnější migraci a invazivitě. Výzkum mechanizmů, které nádorové buňky využívají pro migraci, má význam pro pochopení vzniku a šíření metastáz a následně pro protinádorovou léčbu. V rámci mé disertační práce jsem se podílel na výzkumu vlastností invazivních nádorových buněk. Porovnávali jsme vlastnosti neinvazivní sarkomové buněčné linie a z ní odvozené, vysoce metastatické linie. Ukázali jsme, že buňky invazivní linie využívají améboidní způsob migrace a vykazují zvýšenou aktivitu Rho/ROCK signalizace. Na vedoucím okraji mají tyto buňky nabohacený aktin a myosin a dochází zde ke generování síly. Buňky neinvazivní linie využívají mezenchymální způsob migrace a generují sílu převážně na zatahujícím se konci. Dále jsme porovnávali buňky dvou linií odvozených od prsního karcinomu. Ukázali jsme, že invazivnější linie, odvozená od méně invazivní, vykazuje větší dynamičnost v přestavbě aktinového skeletu. Rovněž jsme u těchto linií popsali přítomnost...
|
|
|
Fyziologické a patofyziologické aspekty metabolismu sulfanu u člověka
Neminářová, Kristýna ; Kožich, Viktor (vedoucí práce) ; Tolde, Ondřej (oponent)
Sulfan (H2S) je po dlouhou dobu známý jako toxický plyn a v poslední době se prokázala jeho funkce jako významné signální molekuly. Sulfan vzniká v malých koncentracích v organismu a fyziologicky působí v celé řadě tkání např. mozku, cévách, plicích. V organismu je tvořen enzymaticky v největší míře z L- cysteinu, přičemž nejvíce se na jeho vzniku podílí enzym cystathionin β-syntáza (CBS, EC 4.2.1.22, L-serin hydro-lyáza) vyskytující se zejména v mozku a cystathionin γ-lyáza (CSE, EC 4.4.1.1, L-cystathionin cystein-lyáza) generující sulfan především v tenkém střevě, portální žíle a hrudní aortě. Sulfan působí jako vazorelaxační faktor v cévách a tím snižuje krevní tlak, v mozku se podílí na přenosu nervového vzruchu. Kromě účinků v mozku a cévách hraje roli v procesech spojených se zánětem nebo v procesu přenosu bolesti. Mezi mechanismy působení sulfanu patří zejména aktivace KATP kanálů (cévy, zažívací trakt, zánět), aktivace NMDA receptorů (mozek), redukce molekul způsobujících oxidativní stres (plíce, mozek), či regulace vstupu vápenatých iontů do buněk (retina). Na základě těchto zjištění je patrné, že by ovlivnění metabolismu sulfanu mohlo mít vysoký terapeutický potenciál, jak u srdečních nemocí, tak u zánětlivých procesů. V popředí zájmu je v současnosti objasnění úlohy sulfanu ve zdraví a...
|
|
|
Mechanismy invazivity a transkripční regulace nádorových buněk
Tolde, Ondřej
Mechanismy invazivity a transkripční regulace nádorových buněk Nádorové onemocnění má svůj původ v normálních tělních buňkách, které se vymknuly kontrole mateřského organismu. Nádorové buňky se pak mohou uvolnit z místa svého vzniku a šířit se po organismu. Pro průchod mezibuněčnou hmotou nebo vrstvou jiných buněk mohou tyto buňky využít mechanismy, které vedou k efektivnější migraci a invazivitě. Výzkum mechanizmů, které nádorové buňky využívají pro migraci, má význam pro pochopení vzniku a šíření metastáz a následně pro protinádorovou léčbu. V rámci mé disertační práce jsem se podílel na výzkumu vlastností invazivních nádorových buněk. Porovnávali jsme vlastnosti neinvazivní sarkomové buněčné linie a z ní odvozené, vysoce metastatické linie. Ukázali jsme, že buňky invazivní linie využívají améboidní způsob migrace a vykazují zvýšenou aktivitu Rho/ROCK signalizace. Na vedoucím okraji mají tyto buňky nabohacený aktin a myosin a dochází zde ke generování síly. Buňky neinvazivní linie využívají mezenchymální způsob migrace a generují sílu převážně na zatahujícím se konci. Dále jsme porovnávali buňky dvou linií odvozených od prsního karcinomu. Ukázali jsme, že invazivnější linie, odvozená od méně invazivní, vykazuje větší dynamičnost v přestavbě aktinového skeletu. Rovněž jsme u těchto linií popsali přítomnost...
|
|
|
Automatizovaný bioreaktor pro kultivaci živých buněk
Ukropcová, Iveta ; Tolde, Ondřej (oponent) ; Dostál, Zbyněk (vedoucí práce)
Řízení kultivačních podmínek při mikroskopování živých buněk rozšiřuje možnosti biologických experimentů a zlepšuje jejich výpovědní hodnotu. Aby změny podmínek byly kontrolované a reprodukovatelné, je nutné omezit množství potřebných úkonů vykonávaných uživatelem mikroskopu a nahradit je automatizovanými procedurami. Proto byl vytvořen koncept nového automatizovaného kultivační zařízení (bioreaktoru). Toto zařízení řídí výměnu média v~pozorovací komoře, zajišťuje cirkulaci a výměnu atmosféry a~kontroluje její složení. Bioreaktor je určen pro použití v Laboratoři experimentální biofotoniky. Tato laboratoř disponuje koherencí řízeným holografickým mikroskopem (CCHM), který využívá metody kvantitativního fázového zobrazování (QPI). Bioreaktor je proto přizpůsoben aktuálním požadavkům této laboratoře a jeho optické části vyhovují nárokům metody QPI. V textu jsou specifikovány kultivační podmínky živých buněk a jsou shrnuty možnosti, jak je lze během mikroskopování řídit. Dále jsou popsána vybraná komerčně dostupná zařízení a je zhodnocena jejich vhodnost pro použití v Laboratoři experimentální biofotoniky. Stěžejní část práce se věnuje návrhu, realizaci a testování nového bioreaktoru.
|
|
|
Bazální membrána a úloha matrix metaloproteináz v průběhu embryonálního hojení ran
Kadlčíková, Dominika ; Šindelka, Radek (vedoucí práce) ; Tolde, Ondřej (oponent)
Proces hojení je atraktivním tématem biologie a medicíny. Existují dva typy mechanismu zacelování ran - u embryí a u dospělých jedinců. V případě embryonálního hojení je celý děj podstatně zjednodušen a zrychlen. Nežádoucí zápalová reakce, vyskytující se u dospělců, je v podstatě eliminována a rána je zhojena bez jizev. Lepší porozumění embryonálního hojení by mohlo vést k efektivnější léčbě úrazů, popálenin a chronických ran u lidí. Velmi důležité je studium molekulárních mechanismů procesu hojení také v souvislosti s pochopením regulace rakovinného bujení. Hojení ran připomíná v mnoha ohledech embryonální vývoj. U toho jsou klíčové tělní osy pro prostorově regulovanou aktivaci vývojově důležitých genů. V této práci byla testována hypotéza, že i orientace vedeného zranění je důležitá pro polaritu a motilitu buněk a při zavírání rány hraje roli, zda je zranění vertikální či horizontální. Významnou částí hojení i rozvoje rakoviny je degradace bazální membrány (BM) a extracelulární matrix (ECM). Ta je spuštěna koordinovaným působením několika tříd enzymů. V této práci byly studovány matrix metaloproteinázy (MMP) a jejich úloha v embryonálním hojení ran. Jedná se o enzymy důležité nejen při hojení, ale i v rozvoji rakoviny. U embryí drápatky vodní (Xenopus laevis) byly na základě RT-qPCR a RNA-Seq...
|
|
|
Cytoskeleton-membrane protein interaction network in sperm
Adamová, Zuzana ; Komrsková, Kateřina (vedoucí práce) ; Tolde, Ondřej (oponent)
Spermie podstupuje několik návazných maturačních procesů, aby mohlo dojít k oplození. Posledním z nich je akrozomální reakce, exocytóza akrozomu, váčku naplněného lytickými enzymy. Akrozomální reakce je zásadní nejen pro průnik spermie skrz vaječné obaly, ale i pro reorganizaci membránových struktur spermie, v rámci které jsou na povrch vystaveny proteiny zásadní pro oplození, zejména pro rozpoznání, vazbu a fúzi gamet. Jedním z těchto proteinů je CD46, který se v intaktních spermiích nachází v akrozomální membráně a po zahájení exocytózy relokuje do ekvatoriálního segmentu hlavičky spermie, kde dochází k prvotnímu kontaktu spermie s plazmatickou membránou vajíčka. Relokaci CD46 zamezuje inhibice aktinu, jehož reorganizace v hlavičce spermie hraje důležitou roli v akrozomální reakci, nicméně není zřejmé, jakým mechanismem CD46 a aktin interagují. V této práci byl studován ezrin, protein propojující membránové proteiny s aktinovým cytoskeletem, v kontextu CD46 a jeho relokace. Imunofluorescenční detekce ezrinu odhalila jeho kolokalizaci s CD46, která je narušena během akrozomální reakce. Přítomnost ezrinu v intaktních i akrozomálně zreagovaných spermiích byla potvrzena technikou western blot. Interakce CD46 a ezrinu byla detekována ko-imunoprecipitací. Na základě těchto zjištění navrhujeme, že...
|
host ::
RSS.