|
Methylace virových RNA
Šimonová, Anna ; Macíčková Cahová, Hana (vedoucí práce) ; Sýkora, David (oponent) ; Elleder, Daniel (oponent)
Viry svým působením zasáhly vývoj všech organizmů. Mají jednoduchou vnitřní organizaci a obsahují menší množství, většinou dobře popsaných RNA. V případě (+)ssRNA virů slouží genomová RNA rovněž jako mRNA. Díky tomu se viry jeví jako ideální modelový systém pro získání informací o nových RNA modifikacích a zároveň k pochopení funkce modifikací již popsaných. V této práci byl jako modelový systém použit zástupce retrovirů, virus lidské imunitní nedostatečnosti typ 1 (HIV-1). V další studii byli testováni čtyři zástupci pikornavirů pro popis methylačního spektra. Pro získání informace o RNA methylacích byla použita kombinace dvou technik, kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí (LC-MS) a sekvenačních technik. Výsledky LC-MS analýzy odhalily velké množství 1-methyladenosinu (m1 A) v RNA izolované z HIV-1. Mapovací technika vytvořená pro m1 A pak potvrdila přítomnost methylace pouze v přibalených tRNA. Tento výsledek následně vedl k přepočítaní RNA složení virové partikule HIV-1. V případě pikornavirů odhalila LC-MS m1 A pouze u dvou hmyzích virů (virus pytlíčkovitého plodu, SBV a virus deformovaných křídel, DWV). Stejně tak byla potvrzena i přítomnost 5-methylcytidinu (m5 C). Následné sekvenační techniky (m1 A mapování a bisulfitové sekvenování) potvrdily přítomnost m1 A a m5 C pouze v tRNA....
|
|
Host-virus interactions of mammalian endogenous retroviruses
Farkašová, Helena ; Elleder, Daniel (vedoucí práce) ; Hirsch, Ivan (oponent) ; Mělková, Zora (oponent)
Endogenní retroviry (ERV) vznikají retrovirovou infekcí zárodečné linie a následným přenosem do dalších generací podle pravidel Mendelovy dědičnosti. Až na pár výjimek jsou všechny druhy savčích ERV evolučně staré a fixované v populaci svých hostitelských druhů. O některých skupinách retrovirů se předpokládálo, že nejsou schopny vytvářet endogenní kopie. Objevili jsme další příklad endogenního Lentiviru a první endogenní Deltaretrovirus. Obě tyto skupiny byly dříve považovány za neschopny vytvářet endogenní kopie. Endogenní lentiviry byly objeveny pouze nedávno a stale se považují za velmi vzácné. Toto jsou stále jen minoritní důkazy z kterých nemůžeme získat celkový obraz o průběhu virové endogenizace. Popsali jsme nový endogenní Lentivirus v genomu letuchy malajské (Galeopterus variegatus) a nazvali ho ELVgv (endogenous Lentivirus of G. variegatus). Na základě několika analýz jsme dokázali, že se jedná o nejstarší dosud objevený Lentivirus, a potvrdili jsme jeho přítomnost v jediném jiném současném druhu Dermopter - Cynocephalus volans. Endogenní deltaretroviry byly poslední retrovirovou skupinou bez nalezeného endogenního člena. Našli jsme zbytky endogenního Deltaretroviru v genomu netopýra létavce natalského (Miniopterus natalensis). Tato retrovirová sekvence byla přítomna v genomu pouze v jedné kopii....
|
|
Study of endogenous retroviruses: Insight into the retroviral evolution and virus-host interactions
Hron, Tomáš ; Elleder, Daniel (vedoucí práce) ; Kejnovský, Eduard (oponent) ; Hirsch, Ivan (oponent)
V rámci mé doktorské práce jsem se věnoval evoluci retrovirů a jejich vztahů s hostitelem. Retroviry jsou skupinou RNA virů schopných infikovat širokou škálu druhů včetně pravděpodobně všech obratlovců. Jejich jedinečnost tkví mimo jiné ve schopnosti účinně tvořit endogenní retroviry (ERVs) - virové kopie, které jsou po integraci do genomu hostitele děděny dalšími generacemi jako součást jejich genofondu. ERVs zastupují velkou část genomu obratlovců a hrají důležitou úlohu v mnoha buněčných procesech a patologiích. Velké množství těchto sekvencí zůstává nicméně stále neprozkoumáno. Výsledky mého hlavního projektu disertační práce odkrývají dávnou evoluční historii retrovirů. K tomu mi dopomohla analýza sekvencí ERVs, které představují jakési "genetické fosílie" virových infekcí, jež probíhaly po celou dobu retrovirové evoluce. Odhalení a následná analýza dávných linií ERVs mi pomohla nahlédnout do hluboké historie retrovirů a prozkoumat, jak virové infekce v minulosti pomáhaly utvářet antivirovou obranu jejich hostitelů. Mimo studium dávné evoluce retrovirů se má práce soustředila také na samotný proces vzniku nových kopií ERVs a jejich fixace v hostitelské populaci. K tomu jsem využil jedinečný model endogenního retroviru, k jehož endogenizaci v současné době dochází u jelence.
|
|
Adaptive evolution of Toll-like receptors in birds
Velová, Hana ; Vinkler, Michal (vedoucí práce) ; Elleder, Daniel (oponent) ; Novák, Karel (oponent)
Adaptive evolution of Toll-like receptors in birds Hana Velová, PhD thesis 7 Abstrakt Toll-like receptory (TLR) patří mezi klíčové a evolučně staré součásti imunitního systému zvířat. Jakožto receptory vrozené imunity tvoří první obrannou linii proti nejrůznějším patogenům. Správné navázání ligandů receptorem je přitom zcela zásadní pro bezchybné rozpoznání patogenů a následné spuštění přiměřené imunitní reakce. Protože zde dochází k přímé interakci mezi povrchem daného receptoru a patogenními strukturami, můžeme předpokládat molekulární koevoluci mezi hostitelem a jeho patogeny. TLR jsou tudíž díky variabilitě svých ligandů vystaveny značnému selekčnímu tlaku, který může být detekován jak na genetické, tak i proteinové úrovni. I tak je ale míra variability, kterou jsme popsali u ptačích TLR, překvapivě vysoká. Dokonce vyšší, než se dalo očekávat z dříve publikovaných prací u ostatních obratlovců, především savců. Ve své doktorské práci shrnuji výsledky, kterými jsem přispěla k výzkumu TLR u ptáků. Jako první jsme například experimentálně ověřili absenci funkčního TLR5 u několika ptačích druhů, či duplikaci genu pro TLR7 u druhů jiných. Také jsme definitivně rozřešili původ genové duplikace v rodině TLR1 a TLR2. Důležitá část mého výzkumného projektu se týkala predikce potenciálně funkčně významných pozic u...
|
|
Regulation of transcription by proteins of the Early growth response and Myb families
Čermák, Vladimír ; Dvořák, Michal (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent) ; Elleder, Daniel (oponent)
Regulace transckripce desítek tisíc genů v organizmu obratlovců je mimořádně komplexním fenoménem, jehož se účastní tisíce různých regulačních proteinů. Největší funkční kategorií těchto regulátorů jsou sekvenčně specifické DNA vazebné proteiny známé jako transkripční faktory. Proteiny z EGR a Myb rodin transkripčních faktorů jsou relativně dlouho zkoumanými regulátory různých fyziologických procesů, včetně buněčné proliferace a diferenciace. Zatímco strukturální a fyzikální aspekty jejich funkce byly dobře charakterizovány, jejich buněčně specifická role v komplexních genově regulačních sítích není dostatečně prostudována a představuje hlavní výzvu v příslušných oblastech výzkumu. Předběžná analýza dat genové exprese z metastázujících buněk PR9692 a nemetastázujících buněk PR9692-E9 (kuřecích sarkomové linie) odhalila, že transkripční faktor EGR1 je syntetizován v relativně větším množství v metastázujících buňkách a může se tak podílet na regulačních procesech, které jsou základem rozdílů mezi oběma buněčnými liniemi. Dalším zkoumáním jsme zjistili, že cílené zvýšení hladiny EGR1 v PR9692-E9 buňkách obnovuje jejich metastatický potenciál na úroveň PR9692 buněk. Mikročipová analýza takových buněk odhalila aktivaci genů, které jsou rozhodující pro kontraktilitu aktinového cytoskeletu (MYL9),...
|
|
POSITIVE AND NEGATIVE HOST FACTORS OF AVIAN SARCOMA AND LEUKOSIS VIRUSES
Krchlíková, Veronika ; Elleder, Daniel (vedoucí práce) ; Růžek, Daniel (oponent) ; Španielová, Hana (oponent)
Identifikace a charakterizace hostitelských faktorů, které umožňují, nebo inhibují virovou replikaci, představuje významný směr ve virologickém výzkumu. V této práci se zaměřujeme na takovéto hostitelské faktory u ptačích buněk. Kuřecí Tva, receptor pro podskupiny A a K ptačích sarkomových a leukózových virů (avian sarcoma and leukosis virus, ASLV), byl určen jako ortolog lidského receptoru pro transport kobalaminu (cobalamin, Cbl). Zde popisujeme transport Cbl v kuřecích buňkách a jeho závislost na Tva. Dále charakterizujeme in vivo kuřecí knockout Tva. Kuřecí Tvb receptor zprostředkuje infekci ASLV podskupinami B, D a E. Již dříve byl prokázán jeho vliv na virem indukovaný cytopatický efekt. V této práci identifikujeme přirozený ligand Tvb a zkoumáme jeho účast v apoptóze. RIG-I-like receptory (RLR) jsou klíčová rodina cytosolových sensorů virové RNA. Jejich aktivace vede k ustavení protivirového stavu buňky. V této práci popisujeme opakované evoluční ztráty RLR genů u ptáků: ztrátu MDA5 u dvou řádů ptáků a ztrátu RIG-I u mnoha ptačích druhů. Tetherin je protivirový restrikční faktor blokující uvolňování nově vytvořených virových partikulí. Zde jsme identifikovali ortology tetherinu u ptáků a popsali protivirovou aktivitu proti ASLV u tetherinu z hrabavých ptáků (Galliformes). Dále jsme...
|
|
Vliv malých DNA virů na regulaci tvorby interferónu
Hofman, Tomáš ; Hirsch, Ivan (vedoucí práce) ; Elleder, Daniel (oponent)
Plasmacytoidní dendritické buňky (pDC) jsou buňky vrozené imunity, schopné rozpoznat viry pomocí jejich endosomálních Toll-like receptorů 7 a 9 (TLR7/9). Po rozpoznání virové nukleové kyseliny dochází k masivní produkci interferonu typu I (IFN I) a navození antivirového stavu v neinfikovaných buňkách. Aktivace regulačních povrchových receptorů pDC, jako je BDCA-2, pomocí monoklonální protilátky nebo jejich ligace některými viry vede k aktivaci MEK1/2-ERK signalizace a inhibici produkce IFN I. V této práci byla vyzdvihnuta role MEK1/2 kinázy, jejíž inhibice zvrátí inhibiční účinek ligace BDCA-2 a jejíž cílená aktivace pomocí PMA vede k inhibici produkce IFN-α. Hlavním cílem této práce bylo objasnění vlivu BK polyomaviru (BKV), zodpovědného za odhojování transplantovaných jater, na pDC. Experimenty s pDC liní Gen2.2 a primární linií buněk ledvin HRPTEC ukázaly, že pDC nejsou schopny přímé detekce BKV částic, avšak BKV inokulum dramaticky potenciuje produkci IFN-α v aktivovaných buňkách Gen2.2. Kokultivace buněk Gen2.2 s BKV infikovanými buňkami HRPTEC vedla k produkci IFN-α a ve větší míře TNF-α, které bylo zabráněno užitím Bafilomycinu. V souhrnu bylo zjištěno, že detekce BKV infikovaných buněk HRPTEC buňkami Gen2.2 vede k produkci cytokinů, která je závislá na buněčném kontaktu a je pravděpodobně...
|
|
Adaptive evolution of Toll-like receptors in birds
Velová, Hana ; Vinkler, Michal (vedoucí práce) ; Elleder, Daniel (oponent) ; Novák, Karel (oponent)
Adaptive evolution of Toll-like receptors in birds Hana Velová, PhD thesis 7 Abstrakt Toll-like receptory (TLR) patří mezi klíčové a evolučně staré součásti imunitního systému zvířat. Jakožto receptory vrozené imunity tvoří první obrannou linii proti nejrůznějším patogenům. Správné navázání ligandů receptorem je přitom zcela zásadní pro bezchybné rozpoznání patogenů a následné spuštění přiměřené imunitní reakce. Protože zde dochází k přímé interakci mezi povrchem daného receptoru a patogenními strukturami, můžeme předpokládat molekulární koevoluci mezi hostitelem a jeho patogeny. TLR jsou tudíž díky variabilitě svých ligandů vystaveny značnému selekčnímu tlaku, který může být detekován jak na genetické, tak i proteinové úrovni. I tak je ale míra variability, kterou jsme popsali u ptačích TLR, překvapivě vysoká. Dokonce vyšší, než se dalo očekávat z dříve publikovaných prací u ostatních obratlovců, především savců. Ve své doktorské práci shrnuji výsledky, kterými jsem přispěla k výzkumu TLR u ptáků. Jako první jsme například experimentálně ověřili absenci funkčního TLR5 u několika ptačích druhů, či duplikaci genu pro TLR7 u druhů jiných. Také jsme definitivně rozřešili původ genové duplikace v rodině TLR1 a TLR2. Důležitá část mého výzkumného projektu se týkala predikce potenciálně funkčně významných pozic u...
|
|
Vzájemné ovlivnění infekce HIV-1 a exprese lidských endogenních retrovirů
Machač, David ; Elleder, Daniel (vedoucí práce) ; Drda Morávková, Alena (oponent)
Cílem této bakalářské práce je popsání vlivu HIV-1 na expresi HERV provirů v infikovaných buňkách, a také, jak přítomnost HERV transkriptů a proteinů dokáže ovlivnit replikační cyklus HIV-1, složení, stavbu a infekčnost jeho virionů. Tyto interakce mohou mít na infekčnost virionů vliv negativní i pozitivní. Například v přítomnosti HIV-1 a HERV proteinů kódovaných geny v regionu gag, které jsou zodpovědné za stavbu kapsidy, nukleokapsidy a matrix virionu, může docházet k jejich promíchání a vytvoření aberantních kapsid, které nebudou schopny sehrát svou úlohu v replikačním cyklu HIV-1. Dále díky jevu zvanému virová pseudotypizace může dojít k začlenění HERV obalových glykoproteinů do membrány HIV-1, čímž může tento virus teoreticky rozšířit svůj tropismus i na jiné buňky než CD4 T-lymphocyty, makrofágy a dendritické buňky. Klíčová slova: HERV, HIV-1, virové pseudotypy, retrovirová replikace
|
|
Vliv malých DNA virů na regulaci tvorby interferónu
Hofman, Tomáš ; Hirsch, Ivan (vedoucí práce) ; Elleder, Daniel (oponent)
Plasmacytoidní dendritické buňky (pDC) jsou buňky vrozené imunity, schopné rozpoznat viry pomocí jejich endosomálních Toll-like receptorů 7 a 9 (TLR7/9). Po rozpoznání virové nukleové kyseliny dochází k masivní produkci interferonu typu I (IFN I) a navození antivirového stavu v neinfikovaných buňkách. Aktivace regulačních povrchových receptorů pDC, jako je BDCA-2, pomocí monoklonální protilátky nebo jejich ligace některými viry vede k aktivaci MEK1/2-ERK signalizace a inhibici produkce IFN I. V této práci byla vyzdvihnuta role MEK1/2 kinázy, jejíž inhibice zvrátí inhibiční účinek ligace BDCA-2 a jejíž cílená aktivace pomocí PMA vede k inhibici produkce IFN-α. Hlavním cílem této práce bylo objasnění vlivu BK polyomaviru (BKV), zodpovědného za odhojování transplantovaných jater, na pDC. Experimenty s pDC liní Gen2.2 a primární linií buněk ledvin HRPTEC ukázaly, že pDC nejsou schopny přímé detekce BKV částic, avšak BKV inokulum dramaticky potenciuje produkci IFN-α v aktivovaných buňkách Gen2.2. Kokultivace buněk Gen2.2 s BKV infikovanými buňkami HRPTEC vedla k produkci IFN-α a ve větší míře TNF-α, které bylo zabráněno užitím Bafilomycinu. V souhrnu bylo zjištěno, že detekce BKV infikovaných buněk HRPTEC buňkami Gen2.2 vede k produkci cytokinů, která je závislá na buněčném kontaktu a je pravděpodobně...
|