|
|
Vliv 17α-ethinylestradiolu na aktivitu cytochromů P450 podrodiny 2B a 2C
Knapp, Kryštof ; Dračínská, Helena (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
17α-ethinylestradiol (EE2) je syntetickým derivátem endogenního estrogenu 17β-estradi-olu široce rozšířeným ve zdravotnictví jednak jako složka ženské hormonální antikoncepce a jed- nak jako léčivo v postmenopauzální hormonální terapii. Díky své značné chemické odolnosti, schopnosti bioakumulace a silné estrogenicitě se jedná o významnou perzistentní organickou látku. V organismech podléhá oxidačnímu metabolismu katalyzovanému enzymy z ro- diny cytochromů P450. Je známo, že se EE2 chová jako účinný inhibitor některých isoforem cytochromů P450. Cílem této práce bylo studium vlivu EE2 na aktivitu lidských isofororem CYP2B6, CYP2C9 a jejich potkaních orthologů CYP2B1 respektive CYP2C6. U všech zkoumaných reakcí byla pozorována snížená aktivita enzymu při expozici EE2 in vitro. Největší pokles aktivity byl pozorován u reakce O-depentylace resoru nu kata- lyzované CYP2B1 s hodnotou IC50 = 9,6 µM. Pro hydroxylaci bupropionu, selektivní reakci isoforem CYP2B1 a CYP2B6, se EE2 jevil jako účinnější inhibitor CYP2B6 s hodnotou IC50 = 60 µM. Inhibice stejné reakce katalyzované CYP2B1 způsobená EE2 byla výrazně slabší. Při 200µM koncentraci EE2 tvořila aktivita CYP2B1 oproti kontrolní aktivitě enzymu stále více než 50 %. Pro určení inhibičního vlivu EE2 na CYP z podrodiny 2C byla použita markerová reakce...
|
|
|
Využití radikálového značení proteinů pomocí Togniho činidel ve strukturní biologii
Fojtík, Lukáš ; Kukačka, Zdeněk (vedoucí práce) ; Kolenko, Petr (oponent)
Metody strukturní proteomiky, mezi které se řadí iontová mobilita, chemické zesítění či kovalentní značení, lze zařadit mezi významné metody studia struktury biomolekul. Tyto metody v posledních dekádách významně přispěly k rozšíření našich znalostí o funkci, dynamice a molekulárních interakcích biomolekul a napomohly tak k pochopení důležitých biologických procesů v buňce. My jsme se rozhodli toto portfolio metod dále rozšířit, a to o přístup využívající fluoralkylové radikály generované Togniho činidly bez nutnosti použít laser. Jako modelové biomolekuly byly zvoleny proteinogenní aminokyseliny, proteiny ubiquitin, a apo- a holoformy myoglobinu. Radikály byly indukovány kyselinou askorbovou a terminovány nadbytkem tryptofanu. Analýza produktů radikálového značení byla prováděna hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením. V případě "Top down" analýzy byly testovány fragmentační techniky ETD, ECD-CID a v případě "Bottom up" byly proteiny štěpeny trypsinem a separovány na koloně s obrácenou fází spojenou s hmotnostním spektrometrem. V případě značení aminokyselin byly označeny všechny aromatické aminokyseliny a cystein. Následné mapování přístupnosti proteinového povrchu k rozpouštědlu fluoralkylovým radikálům přineslo strukturní informace, které jsou ve shodě se známou prostorovou strukturou...
|
|
|
Analýza postranslačních modifikací proteinů hmotnostní spektrometrií
Musil, Dominik ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Viry, původci mnoha infekčních onemocnění, jsou malé nebuněčné částice replikující se pouze v hostitelských buňkách. Předpokládá se, že za jejich infektivitu jsou zodpovědné posttranslační modifikace virových kapsidových proteinů (např. fosforylace, které jsou katalysovány kinasami hostitelských buněk). Vhodným modelem, který lze využít pro studium vztahu fosforylačního "profilu" viru a infektivity je myší polyomavirus z čeledi Polyomaviridae. Srovnáním virionů, a tedy i hlavních kapsidových proteinů VP1 divokého kmene myšího polyomaviru s virovou mutantou vytvořenou pomocí delece části genomu kódujícího regulační proteiny viru a produkovaných ve dvou různých buněčných liniích WOP a 3T6, byla zjištěna hmotnostní spektrometrií majoritní fosforylace na třech konkrétních aminokyselinách VP1. Ty jsou považovány za důležité pro správnou morfogenesi virionů a jejich schopnost infikovat hostitelské buňky. Kvalitativní zastoupení nebylo ovlivněno volbou buněčné linie. Kromě toho, v případě pozorování "dimerizace" VP1 na elektroforeogramu SDS-PAGE byla v aminokyselinové sekvenci detekována dvojitá fosforylace VP1: pThr63, pSer66 v našem experimentálním provedení in vivo. Je tedy pravděpodobné, že posttranslační modifikace, konkrétně fosforylace mohou ovlivňovat strukturní vlastnosti virových proteinů....
|
|
|
Využití hmotnostního spektrometru při aminokyselinové analýze
Matoušková, Zuzana ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Aminokyselinová analýza našla v průběhu let uplatnění napříč mnoha obory. Díky prvotnímu účelu, pro který byla vyvinuta si s sebou nese určité problémy jako je např. chybějící asparagin, glutamin a tryptofan. Existuje spoustu aplikací, ve kterých je potřeba kvantifikovat i tyto chybějící aminokyseliny. Rychlejší, ale méně citlivou alternativou by mohla být detekce pomocí hmotnostní spektrometrie, která navíc umožňuje analýzu i ostatních metabolitů a látek bez aminoskupiny. Aby byla nově vyvinutá metoda užitečná je potřeba znát její možnosti a limity. Tato práce zahrnuje jak metodu, ve které se jednotlivé aminokyseliny separují na hydrofilní interakční chromatografii a následně detekují pomocí hmotnostní spektrometrie, tak její základní charakterizaci a porovnání s dosud běžně používanou fluorescenční metodou, komerčně dostupnou od firmy Waters.
|
|
|
Studium strukturně funkčních vztahů elektrotransportních proteinových systémů
Tuzhilkin, Roman ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Studium procesů spojených s přenosem elektronu v proteinech je velice důležitou oblastí moderní biochemie a strukturní/funkční proteomiky. Azurin je jedním z nejpoužívanějších modelových systémů pro studium oxidačně-redukčních a elektron transportních procesů v proteinech. V této práci jsme použili metodiku kovalentního fotochemického zesítění (PIXL) pro studium oligomerizace azurinu v roztoku. Zároveň jsme studovali vliv L-2- amino-5,5-azi-hexanové kyseliny (foto-Met), strukturního světlem indukovatelného analogu přirozené aminokyseliny Met, na elektron transportní procesy v azurinu. Byla provedena optimalizace podmínek exprese rekombinantního azurinu v auxotrofních buňkách E. coli B834 za účelem získání azurinu s maximální mírou inkorporace foto-Met (70% inkorporace určená MALDI-TOF hmotnostní spektrometrií). Současně modifikací purifikačního protokolu (např. rozbití buněk, kyselá precipitace proteinů, zavedení kovového ligandu při sonikaci buněk) jsme zvýšili čistotu a výtěžek preparátu a zkrátili dobu purifikace. Získané preparáty azurinu (přirozený protein (WT) s Met, WT s foto-Met a "All-Phe" mutant (všechny Trp/Tyr zaměněny za Phe) s foto-Met) byly po ozáření UV světlem (metodika PIXL) charakterizovány pomocí UV-VIS spektroskopie a SDS-PAGE. Při experimentu PIXL některý z foto-Met zavedených...
|
|
|
Příprava mutantních forem cytochromu b5 s fotoreaktivními aminokyselinami a jejich síťování s vazebnými partnery
Landl, David ; Ječmen, Tomáš (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Cytochrom b5 plní funkci přenašeče elektronů v klinicky významném systému oxygenas se smíšenou funkcí (MFO systému). Tento systém se podílí na zvýšení hydrofility látek v první fázi biotransformace xenobiotik a na aktivaci nebo deaktivaci některých léčiv a karcinogenů. Cytochrom b5 ovlivňuje reakce katalyzované terminálními oxygenasami systému - cytochromy P450. Donory elektronů cytochromu b5 jsou NADH:cytochrom b5 reduktasa a NADPH:cytochrom P450 reduktasa Cílem této práce bylo ověřit, zda je možné pomocí metody foto-chemického zesítění fixovat transientní interakce mezi těmito proteiny. Takto získané kovalentní komplexy mohou být dále analyzovány pomocí hmotnostní spektrometrie a poskytují strukturní informace o vazebných místech proteinů. Pro účely foto-síťování byl připraven mutantní cytochrom b5 obsahující v sekvenci v pozici 41 foto-aktivovatelný analog methioninu. Protein jsme exprimovali ve 300 ml limitního média, ve kterém byl methionin nahrazen L-2-amino-5,5-azi-hexanovou kyselinou (foto-methionin), a použili k tomu auxotrofní kmen bakterií E. coli B834(DE3). Míra inkorporace nepřirozené aminokyseliny byla po 16 h exprese stanovena pomocí hmotnostní spektrometrie na přibližně 40 %. Izolací jsme získali celkem 15,4 nmol mutantního cytochromu b5 o koncentraci 76,8 µmol/l. Získaný...
|
|
|
Characterization of protein structures using chemical cross-linking and mass spectrometry.
Kukačka, Zdeněk ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Rozbeský, Daniel (oponent) ; Hernychová, Lenka (oponent)
Některé bílkoviny k plnění své funkce vyžadují přítomnost specifického ligandu, kofaktoru nebo prostetické skupiny. Vazba této specifické molekuly může v molekulách bílkovin způsobit konformační změny. V některých případech může charakterizace takovýchto konformačních změn představovat velmi náročný úkol. V předkládané práci je popsán nový přístup sloužící ke sledování těchto změn pomocí kombinace chemického zesítění a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením. Na modelovém systému, kterým byl zvolen protein kalmodulin, je ukázáno, že analýza pomocí izotopově značených síťovacích činidel umožnuje získat přehled o změnách struktury způsobených přítomností nebo nepřítomností ligandu. Byly rovněž popsány potenciální nedostatky metody, které tkví především v nedostatečné proteolýze proteinu. Tato nová metoda, která zároveň umožňuje kvantifikaci strukturních změn proteinů, byla použita spolu s dalšími technikami k charakterizaci neutrální trehalasy Nth1 v komplexu s proteinem Bmh1 (kvasinková forma proteinu 14-3-3). Výsledky odhalily, že vazba proteinu Bmh1 vyvolává přeskupení molekuly Nth1 se změnami především v tzv. "EF-hand" podobném motivu, který je nezbytný pro aktivační proces.
|
|
|
Výzkum Struktury β-N-Acetylhexosaminidasy z Aspergillus oryzae
Kukačka, Zdeněk ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
v češtině β-N-acetylhexosaminidasa (EC 3.2.1.52) patří do skupiny exoglykosidas a vyskytuje se prakticky u všech organismů od bakterii po člověka. Plísňová β-N-acetylhexosaminidasa z Aspergillus oryzae se skládá z propeptidu a katalytické podjednotky. Propeptid je na katalytickou podjednotku vázán nekovalentně a je nezbytný pro aktivitu enzymu. Ačkoli struktura katalytické podjednotky byla navržena pomocí homologního modelování, struktura propeptidu ještě doposud odhalena nebyla. V této studii jsme se snažili nalézt oblast, kde se propeptid na katalytickou podjednotku váže. Předkládaná práce se skládá ze dvou částí. První část se zabývá optimalizaci podmínek produkce, purifikace a krystalizace β-N-acetylhexosaminidasy z vláknité houby Aspergillus oryzae. Druhá část je věnována samotnému studiu interakce propeptidu a katalytické podjednotky, která byla charakterizována technikou chemického zesítění. A právě prostřednictvím chemického zesítění a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením byly odhaleny ne jenom strukturní změny katalytické podjednotky, které jsou závislé na přítomnosti či nepřítomnosti propeptidu, ale i oblasti, kde propeptid interaguje s katalytickou podjednotkou.
|
|
| |
host ::
RSS.