|
|
Y1 a Y2 transponázy, mechanizmus transpozice, biologická funkce.
Zahradník, Jiří ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Schierová, Michaela (oponent)
Transponázy jsou enzymy katalyzující štěpení, přenos a opětovné vložení mobilního genetického elementu do DNA. Tyrozinové transponázy zaujímají mezi těmito enzymy zcela unikátní postavení. Jejich výjimečnost je dána strukturou a odlišným mechanizmem transpoziční reakce, v kterém vždy figuruje kovalentní fosfotyrozinový intermediát. Nezbytná přítomnost katalytického tyrozinu dala těmto enzymům jméno a zároveň je umožňuje dále členit na skupinu nesoucí pouze jeden katalytický tyrozin - Y1 transponázy a na skupinu se dvěma - Y2 transponázy. Tato práce shrnuje současné poznatky o skupině tyrozinových transponáz. Zabývá se jejich výskytem, strukturou, reakčním mechanizmem a biologickou funkcí. Detailně je popsán reakční mechanizmus nejvíce prostudované Y1 transponázy asociované s IS608 elementem. Dále se práce zaměřuje na ostatní členy rodiny tyrozinových transponáz nesoucí charakteristický HUH motiv: Transponázy asociované s inzerčními sekvencemi rodiny IS200/IS605 (Y1), transponázy asociované s REP elementy (tzv. RAYT proteiny), transponázy asociované s IS91 (Y2), transponázy se společným regionem (ISCRs, Y1) a neobvyklé eukaryotní transponázy rodiny Helitron (Y2). Mezi tyrozinové transponázy patří dva jedinečné příklady domestikace těchto enzymů u prokaryot (RAYT, IStrony). Charakterizace mechanizmu...
|
|
|
Bakteriofágy - současné poznatky a možnosti jejich terapeutického využití
Glendová, Kristýna ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Bakteriofágy, jako viry bakterií, jsou nejrozšířenější organismy, které osidlují všechny biotopy, v nichž se nachází i bakterie. Jednou z alternativ boje proti infekcím, způsobených rezistentními kmeny bakterií, se v současné době jeví bakteriofágová terapie, která spočívá v aplikaci lytických bakteriofágů, či pouze bakteriofágových enzymů k potlačení růstu bakterií. Práce zmiňuje historii fágové terapie, stěžejní část práce se zabývá shrnutím současných trendů v bakteriofágové terapii, která se začíná rozvíjet v posledních letech. Mnoho studií se věnuje možnostem léčby bakteriálních infekcí fágovými lyzáty, včetně geneticky modifikovaných bakteriofágů a dále možnosti použití samotných bakteriofágových enzymů - endolysinů, či kombinaci fágových lyzátů a endolysinů s antibiotiky. Hlavními zájmy ve studiích jsou účinnost, specifita a bezpečnost terapie. Účinnost bakteriofágové terapie byla prokázána mnoha studiemi, jak in vitro, tak i in vivo. Bezpečnost terapie pro využití v klinické praxi se ale musí potvrdit stále málo prozkoumanými in vivo experimenty. Klíčová slova: bakteriofágy, bakteriofágová terapie, endolysiny, enzybiotika, multirezistence,
|
|
| |
|
|
Geny antibiotické rezistence u půdních aktinobakterií
Patrmanová, Tereza ; Kopecký, Jan (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Aktinobakterie jsou důležitou součástí půdních ekosystémů, kde se podílí na rozkladu organické hmoty. Pro tyto bakterie je tak důležitý sekundární metabolismus, který jim umožňuje produkovat bohatou škálu různých látek. Mezi tyto látky se řadí antibiotika, z nichž si své místo v klinické praxi našly i aminoglykosidy. Tato antibiotika jsou významná díky širokému spektru účinku vůči gramnegativním a grampozitivním bakteriím. Jejich používání však v současné době nese rizika, spočívající především v jejich toxicitě, ale také v rozvoji antibiotické rezistence u bakterií, která snižuje jejich účinnost. Aktinobakterie se jako producenti aminoglykosidů musí chránit i před těmito látkami, což dokazuje pestrost typů rezistence, z nichž nejprostudovanější je enzymatická inaktivace. Aktinobakterie si v evoluci vytvořily různé mechanismy, které přispívají k odolnosti vůči látkám s antimikrobiálním účinkem. Geny kódující odolnost k antibiotikům mají v půdním prostředí široké zastoupení. To je ovlivněno mnoha faktory, zejména selekcí bakterií v půdě kontaminované antibiotiky a také kontaktem se zástupci pocházejícími z lidských a živočišných odpadů. Důležitou roli zde hraje horizontální přenos genetické informace, který umožňuje rozšíření genů rezistence mezi fylogeneticky nepříbuznými bakteriemi. Powered by...
|
|
|
Bakteriální REP elementy: původ, variabilita a využití.
Nunvář, Jaroslav ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Pačes, Jan (oponent) ; Melter, Oto (oponent)
6 ABSTRAKT (česky) Tato práce shrnuje tři publikace, jejichž jednotícím tématem jsou bakteriální REP (angl. repetitive extragenic palindrome) elementy. REP elementy jsou jednou z nejznámějších a nejlépe charakterizovaných skupin repetitivních DNA sekvencí u bakterií. Jsou známé především u gamaproteobakterií, včetně enterobakterií. Vyskytují se v nekódujících oblastech hostitelských genomů, zpravidla ve stovkách kopií. REP elementy jsou typicky agregovány do repetitivních útvarů vyšších řádů. U gramnegativní modelové bakterie Escherichia coli byly popsány interakce REP elementů s několika důležitými proteiny buněčné fyziologie, svědčící o významné roli těchto sekvencí pro hostitelskou buňku. První studie (Nunvar et al. 2010) prezentuje objev třídy proteinů příbuzných tyrosinovým transponázám ze skupiny IS200/IS605 inzerčních sekvencí. Tyto proteiny, pojmenované RAYT (angl. REP-associated tyrosine transposase), jsou charakteristické přítomností specifických motivů v jejich aminokyselinové sekvenci, nepřítomných u kanonických IS200/IS605 transponáz. Dalším společným znakem je uspořádání genů kódujících RAYT proteiny. Tyto geny se v hostitelském chromozomu vyskytují vždy v jedné kopii a jsou z obou stran ohraničeny alespoň dvěma REP elementy v inverzní orientaci. Na základě podobnosti mezi systémem...
|
|
|
Vliv vyřazení genu yxkO při adaptaci na enviromentální stres u rodu Bacillus.
Tkadlec, Jan ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
V předchozích letech jsme v naší laboratoři popsali mutanta Bacillus subtilis, který vykazoval snížený růst při vystavení osmotickému stresu za limitující koncentrace K+ . Tento mutantní kmen nesl přerušení v genu yxkO kódujícím předpokládanou ribokinázu. Tento gen patřící do sigma B operonu je indukován osmotickým, teplotním a etanolovým šokem. Při srovnání s divokým kmenem, má tato mutace pleiotropní vliv na fenotyp nositelského kmenu. Kromě osmosenzitivity se mutant liší tvarem buňky, schopností motility a sporulace. Naším cílem bylo zaměřit se na projevy mutace v genu yxkO u dalších bakterií z rodu Bacillus. Připravili jsme mutanty s přerušením tohoto genu, pomocí plazmidu pMUTIN4, odvozené od kmenů lišících se okolím tohoto genu a úrovní laboratorní domestikace Bacillus amyloliquefaciens a Bacillus subtilis subsp. spizizenii. Obdobně jako v předchozích studijích (u laboratorního kmenu Bacillus subtilis 168) jsme popsali u mutantního kmenu odvozeného od Bacillus amyloliquefaciens zhoršenou schopnost růstu při limitaci draslíkem a za osmotického šoku. Tento fenomén jsme studovali na úrovni dynamiky růstu bakteriální kultury. Dále jsme detekovali zvýšenou citlivost kmenu odvozeného od Bacillus amyloliquefaciens k tetracyklinu, změnu morfologie těchto buněk a jejich motility. Mutace v přírodním...
|
|
|
Účast alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při regulaci exprese genů Corynebacterium glutamicum
Šilar, Radoslav ; Nešvera, Jan (vedoucí práce) ; Branny, Pavel (oponent) ; Lichá, Irena (oponent)
Abstrakt Regulace transkripce sigma faktory RNA polymerasy s extracytoplazmatickou funkcí (ECF) představuje velmi účinný nástroj pro adaptaci buňky na stresové podmínky vyvolané změnami ve vnějším prostředí. Gram-pozitivní, aerobní bakterie Corynebacterium glutamicum je významným producentem aminokyselin. V genomu C. glutamicum se nachází 7 genů kódujících sigma faktory: primární sigma faktor SigA, sigma faktor SigB označovaný jako primary-like sigma faktor a 5 ECF sigma faktorů (SigC, SigD, SigE, SigH a SigM). Gen sigH, kódující sigma faktor SigH se nachází v těsné blízkosti genu rshA kódujícího jeho anti-sigma faktor. Anti-sigma faktory se reverzibilně vážou k příslušným sigma faktorům, čímž blokují jejich aktivitu. Za stresových podmínek je vazba mezi oběma proteiny rozrušena a uvolněný sigma faktor se může vázat k jádru RNA polymerasy a aktivovat iniciaci transkripce. V práci byla studována především regulace exprese genů kódujících nejvýznamnější ECF sigma faktor SigH a jeho anti-sigma faktor RshA a geny patřící k jeho regulonu. Transkripční analýzou operonu sigH-rshA byly identifikovány čtyři vegetativní promotory genu sigH a jeden SigH-dependentní promotor genu rshA. Účast komplexu SigH-RshA na regulaci exprese genů byla zkoumána s použitím delečního kmene C. glutamicum ΔrshA. Metodou DNA...
|
|
|
Úloha malých efektorových molekul při signalizaci u bakterií.
Kolář, Petr ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Hilská, Markéta (oponent)
Malé efektorové molekuly plní důležitou úlohu ve fyziologii bakterií. Jsou rozděleny do několika podkategorií molekul, vyskytujících se v bakteriální buňce. Jednu z nich tvoří malé signální molekuly mechanizmu quorum sensing, které v rámci extracelulární signalizace umožňují mezibuněčnou komunikaci v bakteriálních populacích. Zprostředkují informaci o buněčné hustotě a různých vlastnostech vnějšího okolí. Další podkategorií malých efektorových molekul jsou modifikované nukleotidy. Účastní se intracelulárních signálních drah, které vedou k regulaci změn životních strategií bakteriálních populací, v závislosti na měnících se zevních podmínkách. Nejlépe prozkoumané jsou signalizační dráhy využívající molekuly c-di-GMP a (p)ppGpp. Podrobné studie byly provedeny u zástupců gram pozitivních (Bacillus subtilis) a gram negativních (Escherichia coli, Vibrio cholerae) bakterií, u kterých bylo také prokázáno propojení signálních drah zprostředkovaných c-di-GMP s mechanizmem quorum sensing (Vibrio cholerae, Xanthomonas campestris). Důležitý objev na poli malých efektorových molekul byla signalizace prostřednictvím c-di-AMP u bakterie Bacillus subtilis. Nové mechanizmy regulace byly rovněž prokázány u nejlépe prozkoumané malé efektorové molekuly cAMP, v kontextu propojení signálních drah (Vibrio cholerae)....
|
|
|
Oxidativní stres u bakterií - s důrazem na modelový organismus Escherichia coli
Moravcová, Andrea ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Většina bakteriálních druhů se během svého života setká s aerobními podmínkami, které pro ně mohou být toxické. Tím se dostávají do stavu oxidativního stresu. Toxicita aerobního prostředí vyplývá z chemických vlastností molekulárního kyslíku a jeho reaktivních druhů (ROS). Aby si bakterie zajistily přežití a prosperitu, musely se těmto podmínkám v minulosti přizpůsobit. Tato práce se přednostně věnuje oxidativně stresovým adaptacím u nejprostudovanějšího bakteriálního modelu - Escherichia coli. Jsou zde popsány adaptace na úrovni regulace transkripce, translace i metabolismu s důrazem na molekulární mechanismy. Hlavním adaptačním mechanismem proti oxidativnímu stresu je jednak deaktivace ROS, dále pak oprava poškozených struktur (makromolekul). Tyto enzymové aktivity jsou regulovány globálně několika transkripčními regulátory. Velmi dobře jsou prostudovány transkripční regulátory OxyR a SoxRS u E. coli. Tyto regulátory jsou konzervovány napříč bakteriálním spektrem, což ale neznamená, že u všech organismů zastávají stejnou funkci. To je důvod, proč byly do této práce zahrnuty i jiné více či méně prostudované bakterie - Bacillus subtilis, Streptomyces coelicolor, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa - a představen jejich způsob využití nejen těchto, ale i jiných, pro tyto bakterie...
|
|
|
Heterologní exprese genu pro esterasu alfa-aminokyselin z kmene Achromobacter sp. CCM 4824 v Escherichia coli BL21(DE3).
Schneiderová, Michaela ; Kyslík, Pavel (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Na chromosomální DNA mikroorganismu Achromobacter sp. CCM 4824, který byl získaný v Laboratoři enzymových technologií, MBÚ AVČR, v.v.i., byl identifikován gen pro enzym hydrolyzující semi-syntetická β-laktamová antibiotika ampicilin a cephalexin s postranním řetězcem D-fenylglycinem. Enzym je zařazen mezi esterasy α-aminokyselin, které jsou zajímavé pro své potenciální využití při kineticky řízené syntéze těchto antibiotik. V několika aspektech mohou být esterasy α-aminokyselin lepší, než současně používané penicilinacylasy, a proto jsou tyto enzymy předmětem širokého zájmu. Chromosomálně nesený gen kódující esterasu α-aminokyselin byl klonován, charakterizován a heterologně exprimován ve zkonstruovaném, vysoce produkčním bakteriálním systému Escherichia coli BL21(DE3)JM5. Produkovaný enzym byl purifikován a byly stanoveny jeho vlastnosti, důležité z hlediska možného použití při výrobě semi-syntetických β-laktamových antibiotik. Klíčová slova: esterasa alfa-aminokyselin, Achromobacter sp., rekombinantní expresní systém, β-laktamová antibiotika
|
host ::
RSS.