|
|
Expression, localisation, and interactome of the RefZ protein during sporulation in Bacillus subtilis.
Paliesková, Anna Mária ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent)
Bacillus subtilis je gram-pozitivní sporulující bakterie. Za nepříznivých životních podmínek zahajuje sporulační proces, jehož výsledkem jsou rezistentní spory. Hlavním regulátorem iniciace sporulace je transkripční faktor Spo0A. Charakteristickým znakem sporulace je tvorba asymetrického septa na buněčném pólu, které rozděluje buňku na větší mateřskou buňku a menší prespóru. Asymetrické septum je umístěno v 1/6 od nejbližšího pólu buňky, a proces lokalizace je komplexní. Jedním z aktérů podílejících se na této lokalizaci je protein RefZ, který reguluje protein FtsZ, tvořící Z-kruh. Z-kruh je důležitý pro formování vegetativního (uprostřed buňky) i asymetrického septa. RefZ konkrétně napomáhá relokalizaci Z-kruhu ze středu buňky k pólům v rané fázi sporulace. Kromě toho je RefZ protein vázající se na DNA, který se váže na vazebné motivy RefZ (RefZ binding motives [RBMs]) v blízkosti počátků replikace (ori) chromozomů, čímž podporuje přesné umístění ramen chromozomů během sporulace. Celý proces sporulace je regulován kaskádou prostorově specifických sporulačních faktorů σ, které rozpoznávají specifické konzervované (konsenzus) sekvence v promotorových oblastech genů, čímž umožňují RNA polymeráze interagovat s promotorem konkrétního genu a zahájit jeho transkripci. Takto faktory σ zajišťují prostorově...
|
|
|
The omega subunit of Bacillus subtilis RNA polymerase.
Mikesková, Klára ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent)
Transkripce je zprostředkována enzymem RNA polymerázou (RNAP). RNAP obsahuje jádro tvořené dvěma podjednotkami α, a po jedné β, β' a ω. Tyto podjednotky jsou konzervované u všech bakterií. Podjednotka ω je malá podjednotka o velikosti 7,6 kDa, která se váže na podjednotku β'. Podjednotka ω je důležitá pro složení a integritu RNAP a výběr promotorů. Toto bylo ukázáno experimenty provedenými na Gram-negativních bakteriích, ale vědomosti o podjednotce ω u Gram-pozitivních bakterií jsou minimální. Ve své diplomové práci jsem charakterizovala ω z modelové Gram-pozitivní bakterie ze skupiny Firmicutes, Bacillus subtilis. Nejprve jsem připravila několik expresních kmenů pro izolaci podjednotky ω z Bacillus subtilis. Následně jsem úspěšně provedla její izolaci, což byl hlavní a původní cíl této Diplomové práce. Dále jsem testovala vliv podjednotky ω na transkripci in vitro pomocí asociace RNAP s primárním faktorem A i s alternativními faktory σF a σE , které regulují sporulaci u Bacillus subtilis. Také jsem studovala vliv podjednotky δ, malé podjednotky RNAP nacházející se u skupiny Firmicutes, a to samostatně, i v kombinaci s podjednotkou ω. Mé výsledky odhalily, že podjednotka ω stimuluje transkripci z promotorů vegetativních i těch asociovaných se sporulací. Navíc, tato stimulace byla synergicky...
|
|
|
Úloha genu yxkO Bacillus subtilis v odpovědi na environmentální stres.
Petrovová, Miroslava ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent)
ÚLOHA GENU YXKO BACILLUS SUBTILIS V ODPOVĚDI NA ENVIRONMENTÁLNÍ STRES Abstrakt Mutace v genu yxkO, který kóduje hypotetickou ribokinázu a patří do regulonu σB obecné stresové odpovědi, vede u Bacillus subtilis ke snížené osmotoleranci za nízkých koncentrací draslíku v médiu. Biologická funkce genu yxkO zatím nebyla popsána, ale mohla by být zapojena do vysokoafinního transportního systému pro draselné ionty, který na rozdíl od Escherichia coli nebyl u Bacillus subtilis doposud objeven. Našim cílem bylo popsat další vlastnosti mutanta v genu yxkO a pokusit se navrhnout úlohu tohoto genu. Použitím integračního vektoru pMutin4 jsme připravily kmen MP2 Bacillus subtilis, který má gen yxkO inaktivovaný. Kmen MP2 vykazuje zpomalený růst v bohatém médiu a je senzitivní k tetracyklinu. Tento kmen dále není schopný vytvářet endospory a buňky jsou delší, což naznačuje poruchu tvorby příčných sept. Metodou dvourozměrné elektroforézy jsme porovnaly proteinové profily kmene MP2 a standardního kmene 1A680 po osmotickém a ethanolovém stresu. U kmene MP2 jsme pozorovaly změny v expresi některých enzymů energetického metabolismu a flagelinu. Závěr naší práce je, že yxkO je regulačním genem, jehož produkt má pleiotropní vliv na mnoho buněčných funkcí.
|
|
|
Účast alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při regulaci exprese genů Corynebacterium glutamicum
Šilar, Radoslav ; Nešvera, Jan (vedoucí práce) ; Branny, Pavel (oponent) ; Lichá, Irena (oponent)
Abstrakt Regulace transkripce sigma faktory RNA polymerasy s extracytoplazmatickou funkcí (ECF) představuje velmi účinný nástroj pro adaptaci buňky na stresové podmínky vyvolané změnami ve vnějším prostředí. Gram-pozitivní, aerobní bakterie Corynebacterium glutamicum je významným producentem aminokyselin. V genomu C. glutamicum se nachází 7 genů kódujících sigma faktory: primární sigma faktor SigA, sigma faktor SigB označovaný jako primary-like sigma faktor a 5 ECF sigma faktorů (SigC, SigD, SigE, SigH a SigM). Gen sigH, kódující sigma faktor SigH se nachází v těsné blízkosti genu rshA kódujícího jeho anti-sigma faktor. Anti-sigma faktory se reverzibilně vážou k příslušným sigma faktorům, čímž blokují jejich aktivitu. Za stresových podmínek je vazba mezi oběma proteiny rozrušena a uvolněný sigma faktor se může vázat k jádru RNA polymerasy a aktivovat iniciaci transkripce. V práci byla studována především regulace exprese genů kódujících nejvýznamnější ECF sigma faktor SigH a jeho anti-sigma faktor RshA a geny patřící k jeho regulonu. Transkripční analýzou operonu sigH-rshA byly identifikovány čtyři vegetativní promotory genu sigH a jeden SigH-dependentní promotor genu rshA. Účast komplexu SigH-RshA na regulaci exprese genů byla zkoumána s použitím delečního kmene C. glutamicum ΔrshA. Metodou DNA...
|
|
|
SigN from Bacillus subtilis: Functional characterization.
Kambová, Milada ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent)
Bacillus subtilis kmen 3610 je ancestrální nedomestikovaný kmen. Liší se od labora- torního kmene 168 v mnoha ohledech. Jedna z odlišností v kmeni 3610 je přítomnost plasmidu pBS32 kódujícího sigma factor N (σN). Tento σ faktor je aktivovaný po poškození DNA, a jeho exprese indukuje buněčnou smrt. Cíle této práce byla sys- tematická charakterizace transkripce tohoto nového σ faktoru. Za prvé jsem ukázala, že pouze predikované promotory na plasmidu, ne na chromosomu, byly aktivní v in vitro transkripcích. Dále jsem určila anitu RNAP se σN k DNA a iniciační NTP (iNTP) jak na relaxované, tak na DNA s nadšroubovicovým vinutím. Aktivita RNAP na relaxovaných σN-dependentních promotorech byla překvapivě vyšší než na promo- torech v DNA s nadšroubovicovým vinutím, což je protikladem k RNAP asociovaných s jinými σ faktory. Tato vlastnost σN-dependentních promotor· nebyla kódovaná v promotorovém jádře. Shrnutě, tato práce přispěla k našemu pochopení bakteriální transkripce. 1
|
|
| |
|
|
Účast alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při regulaci exprese genů Corynebacterium glutamicum
Šilar, Radoslav ; Nešvera, Jan (vedoucí práce) ; Branny, Pavel (oponent) ; Lichá, Irena (oponent)
Abstrakt Regulace transkripce sigma faktory RNA polymerasy s extracytoplazmatickou funkcí (ECF) představuje velmi účinný nástroj pro adaptaci buňky na stresové podmínky vyvolané změnami ve vnějším prostředí. Gram-pozitivní, aerobní bakterie Corynebacterium glutamicum je významným producentem aminokyselin. V genomu C. glutamicum se nachází 7 genů kódujících sigma faktory: primární sigma faktor SigA, sigma faktor SigB označovaný jako primary-like sigma faktor a 5 ECF sigma faktorů (SigC, SigD, SigE, SigH a SigM). Gen sigH, kódující sigma faktor SigH se nachází v těsné blízkosti genu rshA kódujícího jeho anti-sigma faktor. Anti-sigma faktory se reverzibilně vážou k příslušným sigma faktorům, čímž blokují jejich aktivitu. Za stresových podmínek je vazba mezi oběma proteiny rozrušena a uvolněný sigma faktor se může vázat k jádru RNA polymerasy a aktivovat iniciaci transkripce. V práci byla studována především regulace exprese genů kódujících nejvýznamnější ECF sigma faktor SigH a jeho anti-sigma faktor RshA a geny patřící k jeho regulonu. Transkripční analýzou operonu sigH-rshA byly identifikovány čtyři vegetativní promotory genu sigH a jeden SigH-dependentní promotor genu rshA. Účast komplexu SigH-RshA na regulaci exprese genů byla zkoumána s použitím delečního kmene C. glutamicum ΔrshA. Metodou DNA...
|
|
|
Využití gelově-založených proteomových technik při analýze genové exprese u prokaryotních a eukaryotních modelů
Petráčková, Denisa ; Weiser, Jaroslav (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent) ; Stulík, Jiří (oponent)
Tato dizertační práce ukázala možnosti využití gelově-separační techniky 2-DE při řešení tří nezávislých vědeckých projektů. Proteomické studie vhodně doplnily výsledky získané i jinými přístupy a přispěly k celkovému zobrazení proteinové situace v daných biologických systémech. Srovnáváním celkového proteomu E. coli bylo identifikováno 61 proteinových změn v souvislosti s vývojem bakteriální populace v přítomnosti antibiotika erytromycinu. Tento "klasický" experiment zahrnoval vhodnou izolaci vzorku, separaci a analýzu bílkovin pomocí 2-DE s následnou identifikací proteinů pomocí MS. Nevýhodou bylo velké množství výsledných dat, které bylo potřeba zpracovat (počítačovou analýzou dat). Naproti tomu v případě studia membránového proteomu B. subtilis při pH stresu bylo třeba primárně modifikovat metodu izolace membránových a s membránou asociovaných bílkovin pro jejich vhodnou separaci na 2-DE Optimalizace zahrnovala především úpravy v použitých chemikáliích-detergentech podílejících se na solubilizaci proteinů a časové prodloužení tohoto procesu. Detegováno bylo následně 5 významných proteinových změn v odpovědi na pH stres týkajících se proteinů AcoB, SodA, YjcH, YwaC a YkwC. Data byla doplněna údaji o rigidizaci membrány B. subtilis v kyselém prostředí (stanoveno pomocí pulzní časově rozlišená...
|
|
|
Studium funkce Ser/Thr proteinkináz a fosfatáz Pseudomonas aeruginosa
Goldová, Jana ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent) ; Španová, Alena (oponent)
Reverzibilní fosforylace proteinů je považována za univerzální mechanizmus v intracelulární komunikaci všech živých organizmů. Tento proces, katalyzovaný proteinkinázami a fosfatázami, umožňuje přeložit extracelulární signály do odpovídající buněčné odpovědi a umožňuje tak adaptaci na změny podmínek v prostředí. V posledních letech byla objevena celá řada Ser/Thr proteinkináz a fosfatáz eukaryotního typu u bakterií, jejich přesná funkce a substráty však nejsou zatím příliš prostudovány. Podmíněný lidský patogen Pseudomonas aeruginosa obsahuje ve svém chromozomu minimálně 5 genů kódujících předpokládané Ser/Thr proteinkinázy a fosfatázy eukaryotního typu. V první části této práce jsme se pokusili stanovit fyziologickou roli Ser/Thr proteinkinázy PpkA a fosfatázy PppA, které jsou součástí sekrečního systému typu VI H1-T6SS. V kmeni P. aeruginosa PAO1 jsme připravili dvojitého delečního mutanta ∆pppA- ppkA. Fenotypová analýza prokázala, že v porovnání s divokým kmenem vykazuje mutantní kmen pomalejší růst v minimálním médiu a sníženou produkci pigmentu pyocyaninu. Mutant dále prokazoval významně sníženou odolnost k oxidativnímu stresu a naopak zvýšenou odolnost k hyperosmotickému stresu. V souladu s pozorovanou sníženou odolností k oxidativnímu stresu mutantní kmen hůře přežíval v baktericidním...
|
|
|
Funkce alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při stresové odpovědi u Corynebacterium glutamicum
Dostálová, Hana ; Nešvera, Jan (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Cílem práce bylo přispět k poznání funkce alternativních sigma faktorů RNA polymerasy σH a σM při stresové odpovědi u Corynebacterium glutamicum, zejména při transkripci genu sigM, který kóduje σM , a operonu dnaK-grpE-dnaJ-hspR, jehož geny kódují proteiny účastnící se odpovědi buňky C. glutamicum na tepelný stres. Promotory těchto testovaných genů byly klonovány do "promoter-probe" vektoru pET2 a jejich aktivita byla stanovována měřením specifické aktivity reportérového enzymu chloramfenikolacetyltransferasy. Byl zjištěno, že tepelný stres má slabý pozitivní efekt na aktivitu promotoru genu sigM (P-sigM), zatímco efekt oxidativního stresu působením diamidu nebyl potvrzen. Bylo prokázáno, že delece samotného genu sigH nebo sigM nevede ke snížení aktivity promotoru P-sigM za standardních podmínek ani po tepelném stresu. Naproti tomu u kmene C. glutamicum ∆sigH∆sigM došlo k úplnému potlačení aktivity tohoto promotoru. Promotor genu sigM je tedy rozeznáván za standardních podmínek i po tepelném stresu jak sigma faktorem σH , tak sigma faktorem σM , ale nikoli primárním sigma faktorem σA . Bylo zjištěno, že mutageneze v -10 oblasti promotoru genu sigM vede k jeho inaktivaci a byla prokázána nezbytnost trinukleotidu GTT 8 bp "upstream" od počátku transkripce genu sigM pro funkci promotoru P-sigM. Z...
|
host ::
RSS.