|
|
Dlouhodobý mírný stres v koloniích Saccharomyces cerevisiae s delecí WHI3
Krampotová, Ester ; Schierová, Michaela (vedoucí práce) ; Dušková, Michala (oponent)
Druh Saccharomyces cerevisiae je vhodným modelem pro studium mnoha biologických procesů, včetně adaptace na stresové podmínky. V posledních 40 letech byla u S. cerevisiae popsána interak- ce mnoha signálních drah při odpovědi na akutní stres vyvolaný vysokou teplotou, osmotickým stresem nebo vysokou koncentrací kovů. Méně dostupných informací je o vlivu subletálních dávek stresoru. Výhodou kmene s delecí WHI3, který jsem v této práci použila, je schopnost reagovat na změnu ve složení média nejen snížením rychlosti růstu, ale i změnou morfologie kolonie. Protein Whi3 nejen stimuluje produkci flokulinu Flo11, ale i aktivitu obecných transkripčních faktorů Msn2 a Msn4. Cílem práce bylo zjistit, zda jsou změny exprese genů kódujících stresové proteiny vyvolané subletálními dávkami inhibitoru závislé na genotypu WHI3, YAP6 a MPT5. Transkripční faktor Yap6 i RNA vazebný protein Mpt5 jsou zapojeny do odpovědi na stres a mají negativní vliv na expresi FLO11. Jejich hladina je závislá na Whi3. K navození stresu jsem využívala nízké koncentrace NaCl a CdSO4, kterými jsem působila po dobu 4 a 6 dnů na kolonie, které se lišily genotypem v genech WHI3, YAP6 a MPT5. Z našich experimentů vyplývá, že i při mírném stresu dochází k aktivaci stresové odpovědi a ke změně morfologie kolonií. Zatímco u všech pěti...
|
|
|
Studium biogeneze transportérů monovalentních kationtů v eukaryotních buňkách
Černá, Karolína ; Zimmermannová, Olga (vedoucí práce) ; Schierová, Michaela (oponent)
Regulace vnitrobuněčné hladiny kationtů alkalických kovů (Na+ , K+ ) a protonů v buňkách většiny organismů (od bakterií po savce) závisí na správné lokalizaci a fungování transportérů těchto kationtů v membránách buněk. Cargo receptory jako součást endoplazmatického retikula a váčků COPII rozpoznávají membránové proteiny a usnadňují jim procházet skrze sekreční dráhu do jejich cílových membrán. Rodina cargo receptorů Erv14/Cornichon je konzervovaná napříč eukaryotními organismy a její členové se podílejí na biogenezi několika transportérů monovalentních katiotů. V této diplomové práci jsme podrobně analyzovali strukturu a funkce vybraných cornichonů z kvasinky Saccharomyces cerevisiae (Erv14) a z člověka (CNIH1-4). Pomocí heterologní exprese lidských cargo receptorů CNIH1, CNIH2 a CNIH4 v kvasince S. cerevisiae jsme zjištovali jejich schopnost nahradit úlohu cargo receptoru Erv14 v toleranci buněk k solím, udržování membránového potenciálu a vnitrobuněčného pH. Ze tří lidských cornichonů byly funkce Erv14 v udržování homeostáze monovalentních kationtů nejlépe komplementovány izoformou CNIH1. Exprese proteinů CNIH v S. cerevisiae také ovlivňovala biogenezi a funkci kvasinkového Na+ , K+ /H+ antiporteru Nha1. Navíc jsme odhalili lidský Na+ /H+ antiporter NHA2 jako dalšího interakčního partnera jak...
|
|
|
Dlouhodobý mírný stres v koloniích Saccharomyces cerevisae s delecí WHI3
Krampotová, Ester ; Schierová, Michaela (vedoucí práce) ; Dušková, Michala (oponent)
Diplomová práce se zabývá vývojem kolonií přírodního nepatogenního kmene kvasinky Saccharomyces cerevisae s delecí WHI3 při dlouhodobém mírném stresu. Kmeny s delecí WHI3 jsou výrazně citlivější ke změnám kultivačních podmínek než rodičovský kmen, a proto mohou být dobrým modelem pro studium vlivu nestandardních podmínek kultivace na zvýšení virulence u patogenních kvasinek. Delecí WHI3 u kmene BR-F dochází k výraznému potlačení schopnosti tvorby strukturovaných kolonií způsobené především sníženou hladinou Flo11. Absence Whi3 má negativní vliv i na expresi genů zapojených do stresové odpovědi. Cílem práce bylo zjistit, zda jsou změny exprese genů kódujících stresové proteiny vyvolané subletálními dávkami inhibitoru závislé na genotypu WHI3, YAP6 a MPT5. K navození stresu u kvasinek využíváme NaCl nebo CdSO4. Geny YAP6 a MPT5 kódují regulační proteiny zapojené do stresové odpovědi a zároveň je jejich hladina ovlivněna proteinem Whi3. U kmene s delecí WHI3 byla hladina Hsp26, Tsa1, Pab1 i Gre2 nižší než u rodičovského kmene. Protein Yap6 ovlivňuje reakci na přítomnost Cd2+ v médiu, ačkoliv podle SGD je popsána pouze jeho funkce při zajištění tolerance k sodným a lithným iontům. Podstatné zjištění, které vyplývá z našich experimentů, je, že i při mírném stresu dochází k aktivaci stresové odpovědi a...
|
|
|
Molekulární podstata syndromu Cornelia de Lange
Vokáčová, Markéta ; Schierová, Michaela (vedoucí práce) ; Jedličková, Jana (oponent)
Syndrom Cornelia de Lange je vzácné, velmi heterogenní, genetické onemocnění, které se řadí mezi kohezinopatie. Příčinou jsou mutace v genech kódujících proteiny kohezinového komplexu nebo jeho regulátory. Dosud bylo objeveno 5 hlavních genů, jejichž defekty jsou zodpovědné za vznik syndromu. Gen, ve kterém došlo k mutaci, ovlivňuje typ dědičnosti, a především rozsah poškození. Vlivem nedostatečné funkce kohezinového komplexu je narušena nejen koheze sesterských chromatid, ale i regulace genové exprese a reparace dvouřetězcových zlomů DNA. Znalosti o příčinách onemocnění rozvíjejí aktuálně probíhající experimenty s živočišnými modely syndromu Cornelia de Lange, buněčnými kulturami od pacientů, ale i s kvasinkou Saccharomyces cerevisiae. Je pravděpodobné, že detailní analýza biologických funkcí kohezinového komplexu umožní vývoj terapeutických metod. Klíčová slova: Syndrom Cornelia de Lange, kohezinový komplex, kohezinopatie, změna transktiptomu, integrita genomu, topologicky asociované domény, NIPBL
|
|
|
Evolution of mixed cultures of the pathogenic yeasts Candida albicans and Candida guilliermondii
Hirko, Dominik ; Heidingsfeld, Olga (vedoucí práce) ; Schierová, Michaela (oponent)
Cílem této práce bylo zjistit, jak se mění kokultury kvasinek Candida albicans a Candida guilliermondii v průběhu času, jednak za kontrolních podmínek a též pod vlivem flukonazolu. Tyto druhy jsou oportunní fungální patogeny, které se značně liší ve své citlivosti k nejčastěji používanému antimykotiku - flukonazolu. Po krátkém úvodu do společných rysů studovaných druhů, jejich mechanizmu patogeneze a léčby infekcí, které způsobují, se tato práce věnuje růstovým křivkám obou mikroorganizmů za vybraných podmínek a taktéž procesu umělé evoluce pomocí modelu pasážování kokultur. Poté byly tyto populace C. albicans a C. guillieromondii zkoumány pomocí qPCR a chromogenních médií. qPCR analýza odhalila, že za kontrolních podmínek v kulturách převládá C. albicans (CA). Možným důvodem je 20 % kratší generační doba, jak ukazuje růstová křivka. V přítomnosti flukonazolu bylo možno pozorovat dva trendy. Jeden souvisí s přirozenou rezistencí C. guilliermondii (CG) a vedl k tomu, že CG byla na konci pasážování dominantní. Druhý trend vedl k dominanci CA, přestože tato kvasinka je za normálních okolností k flukonazolu citlivá. Na základě tohoto zjištení byla testovaná minimalní inhibiční koncentrace (MIC50) náhodně vybraných kolonií CA. V experimentu, kde ve 12. pasáži CA převládla, došlo až k 10- násobnému...
|
|
|
The use of cell-free nucleic acids in maternal plasma for non-invasive prenatal diagnosis of monogenic diseases, placental insufficiency-related complications and Down syndrome
Veselovská, Lenka ; Hromadníková, Ilona (vedoucí práce) ; Schierová, Michaela (oponent)
Od objavu extracelulárnej fetálnej DNA v periférnej krvi tehotných ien sú extracelulárne nukleové kyseliny skúmané vo vz ahu k neinvazívnej prenatálnej diagnostike rôznych fetálnych vlastností a porúch, a tie komplikácií v tehotenstve. Neinvazívna prenatálna diagnostika monogénne dedi ných porúch reprezentovaných TSC1-viazanou tuberóznou sklerózou je teoreticky mo ná prostredníctvom detekcie paternálne zdedenej mutovanej alely medzi materskými alelami v krvnej plazme. Spo ahlivos detekcie mutovanej alely mô e by zvý ená simultánnou analýzou haplotypu viazaného s mutovanou alelou alebo detekciou univerzálneho fetálneho markeru. iadna z troch metód (alelovo- pecifická PCR v reálnom ase, SNaPshot minisekvenovanie a kvantitatívna fluorescen ná PCR) testovaných s pou itím umelo vytvorených zmesí vzoriek a vzoriek materskej plazmy nebola dostato ne spo ahlivá a presná v detekcii minoritnej alely odli nej v bodovej mutácii, jednonukleotidovom polymorfizme alebo v mikrosatelite v géne TSC1 alebo v jeho okolí. Vytvorili sme model predikcie podielu párov informatívnych pre panel jednonukleotidových polymorfizmov, ktorý mô e by aplikovaný pre akúko vek monogénne dedi nú poruchu. Nepodarilo sa nám nájs funk ný fetálny marker s vyu itím rozdielnej metylácie promótorov génov RASSF1A, HLCS a OLIG2 v materskom a...
|
|
|
Turnerův syndrom a jeho souvislost s inaktivací chromozómu X
Kašíková, Lenka ; Schierová, Michaela (vedoucí práce) ; Král, Jiří (oponent)
Turnerův syndrom (TS) je genetické onemocnění žen s celosvětovou frekvencí výskytu 1:2 000. Jeho příčinou nemusí být pouze monozómie chromozómu X (45,X), nýbrž i mozaikový karyotyp (45,X/46,XX; 45,X/46,XY; 45,X/47,XXX), izochromozóm X (46,X,i(Xq)), ring chromozóm X (45,X/46,X,r(X)) nebo další strukturní aberace chromozómu X (delece a translokace). U pacientek s TS (s výjimkou pacientek s ring chromozómem) není diagnostikována mentální retardace. TS úzce souvisí s regulací exprese genové dávky, především s procesem inaktivace chromozómu X. Geny unikající procesu inaktivace chromozómu X, jsou u ženy karyotypu 45,X exprimovány v nesprávné, poloviční dávce ve srovnání se zdravou ženou. Příkladem takového genu je SHOX, na který jsem se soustředila ve své bakalářské práci. Haploinsuficience genu SHOX způsobuje majoritní fenotypový projev TS, kterým je malá postava a kostní abnormality. Výzkum dalších genů, odpovědných za TS, komplikuje skutečnost, že neexistuje vhodný modelový organizmus, na kterém by bylo možné TS studovat a výsledky extrapolovat na člověka. U myších samic se liší nejen samotný proces inaktivace chromozómu X, ale i fenotypové projevy s karyotypem 39,X jsou daleko mírnější než u žen s karyotypem 45,X, což lze vysvětlit skutečností, že u myši uniká procesu inaktivace chromozómu X pouze...
|
|
|
Prevalence vybraných polymorfizmů v genu pro receptor luteinizačního hormonu v české populaci a u pacientek s ovariálním hyperstimulačním syndromem
Chrudimská, Jana ; Macek, Milan (vedoucí práce) ; Schierová, Michaela (oponent)
Ovariální hyperstimulační syndrom (OHSS) je komplikací technik asistované reprodukce (ART), která potenciálně může ohrozit život pacientky. Je způsoben zvýšenou citlivostí ovarií na léčbu gonadotropiny při kontrolované hyperstimulaci ovarií (COH). Míru ovariální odezvy přitom mohou jemně regulovat polymorfizmy v genech pro gonadotropiny a jejich receptory. Cílem této studie je zjistit prevalenci polymorfizmů Asn291Ser (rs1470652), Ser312Asn (rs2293275) a insLQ (inzerce leucinu a glutaminu, rs58356637) v genu pro receptor luteinizačního hormonu a choriového gonadotropinu (LHCGR) u 102 českých fertilních mužů, 149 fertilních žen a u 58 pacientek, u kterých se rozvinul závažný stupeň OHSS. Polymorfizmy Asn291Ser a Ser312Asn byly detekovány pomocí TaqMan SNP Genotyping Assay, insLQ na kapilární elektroforéze s fluorescenčně značenými primery. Zjištěné prevalence studovaných polymorfizmů v české fertilní populaci jsou ve shodě s většinou výsledů z ostatních evropských studií. Nebyl zjištěn rozdíl v jejich prevalenci mezi muži a ženami, stejně jako nebyl objeven žádný vztah těchto polymorfizmů k rozvoji OHSS. Na provedení haplotypové analýzy byl počet analyzovaných vzorků příliš nízký. Získaná data budou použita pro následné asociační studie v oblasti dysfertility, hormonálně dependentních onemocnění a nádorů...
|
|
|
Vliv Vps34p na růst a vývoj kvasinkových kolonií
Červenka, Jakub ; Schierová, Michaela (vedoucí práce) ; Převorovský, Martin (oponent)
Fosfatidylinositol-3-kinázová (PI3K) signální dráha je evolučně konzervována u všech eukaryotických organizmů a její hlavní funkcí je regulace autofágie a cílení proteinů do vakuoly/lyzozomu. Pro patogenní kvasinky druhů Candida albicans a Cryptococcus neoformans je PI3K signální dráha nezbytná pro jejich virulenci. U kvasinky Saccharomyces cerevisiae je PI3K signální dráha tvořena dvěma proteiny - Vps34p, který je fosfatidylinositol-3-kinázou, a jeho regulátorem Vps15p. V rámci této diplomové práce jsem se zabýval vlivem PI3K signální dráhy na růst a vývoj kolonií přírodních i laboratorních kmenů S. cerevisiae. Ověřil jsem, že delece VPS34 či VPS15 má u laboratorních haploidních kmenů významný vliv na velikost kolonií a na invazivní růst (u kmene ΣSh vps15Δ). Delece VPS34 nebo VPS15 také zvyšuje citlivost buněk k oxidativnímu stresu a detergentům. Kmeny bez VPS34 odvozené od přírodních kmenů se nepodařilo připravit, pravděpodobně pro jeho esencialitu u těchto kmenů. Konstitutivní exprese VPS34 neovlivňuje rezistenci buněk při inhibitorových testech, velikost a diferenciaci kolonií ani amoniakovou signalizaci, rozdíly však lze pozorovat v morfologii makrokolonií a způsobu jejich zarůstání do média. Značení Vps34p na C-konci pomocí GFP negativně ovlivňuje funkci Vps34p a u haploidních kmenů vede k...
|
|
|
Mutační analýza genu TRPC6 u pacientů s nefrotickým syndromem
Obeidová, Lena ; Reiterová, Jana (vedoucí práce) ; Schierová, Michaela (oponent)
Fokální segmentální glomeruloskleróza je jednou z nejčastějších příčin vzniku nefrotického syndromu u dospělých pacientů. Jedná se o poškození glomerulů charakterizované únikem proteinů do moči a edémy, jež se zpravidla do deseti let vyvine v chronické selhání ledvin. V posledních letech byla popsána familiární forma tohoto onemocnění vznikající po poškození proteinů tvořících filtrační bariéru ledvin. Mezi tyto proteiny byl roku 2005 přiřazen i neselektivní iontový kanál TRPC6. V této práci jsem se zaměřila na shrnutí dosavadních poznatků o nefrotickém syndromu, fokální segmentální glomeruloskleróze a zapojení TRPC6 na jejich vzniku. V praktické části jsem se zabývala screeningem mutací a polymorfismů v genu TRPC6 u 47 pacientů s histologicky potvrzenou fokální segmentální glomerulosklerózou či minimálními změnami glomerulů pomocí metody high resolution melting a přímou sekvenací. V souboru pacientů jsem neobjevila žádnou patogenní mutaci, pouze 2 známé polymorfismy P15S a A404V a několik záměn neměnících aminokyselinu. Zdá se tedy, že mutace v genu TRPC6 způsobující fokální segmentální glomerulosklerózu jsou v české populaci dospělých pacientů vzácné.
|
host ::
RSS.