|
|
Molekulární mechanismy adaptace živočišných buněk na hyperosmotický stres
Novotná, Jana ; Vávra, Jiří (vedoucí práce) ; Převorovský, Martin (oponent)
Nejrůznější buněčné typy, které tvoří živočišné tkáně, se musí vyrovnávat a extracelulárními změnami osmolarity, aby si udržely svou homeostázu. Hypertonicita (zvýšená osmolarita) je jedním z faktorů, který v buňkách spouští komplexní odpověď. Aby byla buňka schopna se s tímto stresem vyrovnat, musí zapojit regulační kaskády, které buď prostřednictvím WNK kináz regulují transportéry iontů anebo je prostřednictvím transkripčního faktoru TonEBP/NFAT5 spuštěna exprese genů pro transportéry kompatibilních osmolytů. Fyziologicky jsou hypertonickým podmínkám vystaveny buňky dřeně ledvin, chrupavek, buňky tkání vnitřního ucha, ve specializovaných neuronech anebo buňkách bukálního epitelu. Práce shrnuje základní a aktuální poznatky o adaptaci buněk na zvýšenou osmolaritu okolního prostředí. Klíčová slova: Hyperosmolarita, osmotický stres, TonEBP, WNK kinázy , NF-κB, HSP70
|
|
|
Rekombinantní příprava DNA vazebné domény transkripčního faktoru TEAD1 pro studium jeho interakcí s DNA
Kúdelová, Veronika ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Proteiny TEAD patří do významné rodiny transkripčních faktorů, které se během vývoje organismu podílí na regulaci jeho růstu a diferenciace buněk prostřednictvím aktivace exprese nejrůznějších genů. Tato rodina sdílí dvě vysoce konzervovaná místa, a to TEA DNA vazebnou doménu, po které tyto proteiny získaly název, a doménu, pomocí níž transkripční faktory váží další koaktivátory. Protože TEAD proteiny nejsou samy o sobě schopné transkripce, interagují s řadou koaktivátorů, které umožňují regulovat transkripci požadovaného genu. Poruchou regulace aktivity TEAD proteinů může docházet ke vzniku nádorových onemocnění. Proto v dnešní době hrají proteiny rodiny TEAD nemalou roli při vývoji nových protinádorových léčiv. Jedním ze způsobů inhibice těchto proteinů je zabránění jejich vazbě na DNA, tedy blokace aktivního místa v DNA vazebné doméně. Tato bakalářská práce se zabývá rekombinantní expresí zmíněné DNA vazebné domény transkripčního faktoru TEAD1, která je prodloužená o aminokyseliny v nestrukturované oblasti. Po nalezení vhodných podmínek produkce bylo přistoupeno k produkci ve velkém objemu následované purifikací a ověřením identity proteinu. Nakonec byla potvrzena schopnost interakce produkovaného proteinu s DNA. Připravený protein bude tedy možné využít ke studiu způsobů jeho interakce s DNA,...
|
|
|
Strukturní charakterizace interakce dvouvláknových DNA s transkripčním faktorem
Kadavá, Tereza ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Hubálek, Martin (oponent)
Transkripční faktory z rodiny proteinů TEAD jsou důležitou součástí mnohých eukaryotických regulačních procesů. Jsou součástí Hippo signální dráhy a podílí se na kontrole diferenciace buněk a apoptózy. Zájem o tyto proteiny též souvisí s jejich spojením s onkologickými onemocněními. DNA-vazebná doména TEAD transkripčních faktorů interaguje s M-CAT elementy dvouvláknové DNA, kterými jsou i sekvence dsDNA z exonu a enhanceru genu C-MYC, jejichž interakce s DNA-vazebnou doménou proteinů TEAD byla v této práci studována především iontovou mobilitou ve spojení s hmotnostní spektrometrií za použití nativní ionizace nanoelektrosprejem. Studiu proteinu TEAD1-DBD a jeho dsDNA komplexů předcházela produkce DNA-vazebné domény TEAD1 dle již optimalizovaného protokolu. TEAD1-DBD a jeho komplexy byly dále studovány pomocí kolizně indukované aktivace a zahřívání sprejovaného roztoku při použití nativní hmotnostní spektrometrie ve spojení s iontovou mobilitou. Při kolizní aktivaci bylo pozorováno kolizně indukované rozbalování proteinu i obou jeho komplexů s DNA. Při zahřívání sprejovaného roztoku bylo sledováno tavení dsDNA i komplexů a z naměřených hodnot byly určeny teploty tavení jednotlivých vzorků. Pomocí kalibrace iontové mobility s putující vlnou byly určeny kolizní průřezy jednotlivých molekul.
|
|
|
Kvasinky jako model pro studium savčích onkogenních transkripčních faktorů
Novák, Josef ; Zámostná, Blanka (vedoucí práce) ; Šťovíček, Vratislav (oponent)
Kvasinky jsou výborným modelovým organismem pro studium buněčných pochodů a za tímto účelem pro ně bylo vytvořeno značné množství technik a protokolů. Pro studium transkripčních faktorů v kvasinkách jsou vytvořeny specifické postupy, jako jsou modifikované kvasinkové dvouhybridní systémy, jednohybridní systémy a systémy zkoumající schopnost transkripčního faktoru transaktivovat reportérový gen. V hlavní části této práce jsou podrobně popsány studie zkoumající savčí onkogenní proteiny komplexu AP-1 a proteinových rodin Myc a Myb. Pomocí kvasinkových modelů lze určovat strukturně- funkční vlastnosti zkoumaných proteinů a v některých případech i odhadnout jejich onkogenní vlastnosti (FASAY, schopnost proteinu c-Myc transaktivovat reportérový gen). Výsledky z kvasinkových modelů ovšem musí být ověřeny v savčích buňkách. 1
|
|
|
Cis a trans elementy uplatňující se v odezvě rostlin na sucho (se zvláštním zřetelem na regulaci fotosyntetických genů)
Panchártek, Daniel ; Holá, Dana (vedoucí práce) ; Feketová, Zuzana (oponent)
Abiotické stresory jako sucho, vysoká koncentrace soli či chlad dokážou velkou měrou ovlivnit vývoj a růst rostlin. Cis a trans elementy jsou jednou z možností, jak mohou rostliny regulovat svůj metabolismus v případě, kdy se jejich aktuální životní podmínky změní v nepříznivé. Tímto způsobem je indukována exprese řady genů, které nefungují pouze ve smyslu navození tolerance, ale i jako obecná odpověď na tyto stresory. Těchto dějů se účastní velká škála transkripčních faktorů a dalších trans faktorů, které se často vážou na specifické sekvence v promotorech - cis elementy. V posledních letech bylo provedeno mnoho prací na toto téma, sucho ale zůstává stále jednou z nejméně probádaných oblastí. Přesto byly popsány hlavní signální dráhy a komplexy kaskád směřující k regulaci exprese cílových genů. Některé z těchto cílových genů souvisejí s fotosyntetickým aparátem a jejich regulace může u rostlin stresovaných suchem výrazně ovlivnit účinnost fotosyntézy. Tato práce stručně popisuje hlavní cis a trans elementy rostlin uplatňující se v odezvě na sucho (se zvláštním zřetelem právě na regulaci fotosyntetických genů). Klíčová slova: sucho, genová exprese, cis-element, transkripční faktor, kyselina abscisová, fotosyntéza, promotor.
|
|
|
Utilization of protein radical foootprinting for stuctural biology
Polák, Marek ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Junková, Petra (oponent)
(In Czech) Mapování povrchu proteinů je jednou z metod strukturní biologie, které poskytují důležité informace o struktuře, dynamice, funkci a vazebných interakcích proteinů. V této práci jsme se k mapování povrchu proteinů rozhodli využít unikátní přístup, kterým je kombinace hmotnostní spektrometrie s rychlou fotochemickou oxidací proteinů (FPOP, z anglického Fast Photochemical Oxidation of Proteins), která k tomuto účelu využívá reaktivní radikály kyslíku. Konkrétně byla v této práci metoda FPOP využita ke studiu interakce proteinu s DNA a to přesněji komplexu DNA-vázající domény proteinu FOXO4 s oligonukleotidem DAF16. V první fázi projektu byl produkován a purifikován protein, jehož vazba na DNA byla ověřena nativní elektroforézou a nativní hmotnostní spektrometrií. Dále byly optimalizovány podmínky oxidace proteinu, a to jak v přítomnosti DNA, tak samostatně a modifikace proteinu byly analyzovány hmotnostní spektrometrií pomocí přístupů top-down a bottom-up. Přístupem bottom-up byla identifikována a kvantifikována modifikovaná residua, což odhalilo rozdíly v oxidaci jednotlivých aminokyselin v přítomnosti a nepřítomnosti DNA. Aby se předešlo možným artefaktům způsobených analýzou vícenásobně oxidovaného proteinu, byla kromě hmotnostně spektrometrické analýzy standardním přístupem bottom-up...
|
|
|
Studium struktury a interakcí vybraných forkhead transkripčních faktorů
Kohoutová, Klára ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent)
Tato magisterská práce vznikla jako součást projektu, jehož cílem je vývoj a studium nízkomolekulárních látek schopných inhibovat aktivitu transkripčního faktoru FOXO3. FOXO3 tvoří spolu s FOXO1, FOXO4 a FOXO6 FOXO podrodinu forkhead rodiny transkripčních faktorů. FOXO transkripční faktory jsou evolučně konzervované proteiny, které se účastní regulace celé řady buněčných dějů, mezi něž spadá regulace apoptózy, buněčného cyklu a metabolismu. Díky své proapototické funkci a schopnosti blokovat buněčný cyklus jsou FOXO proteiny považovány za tumorové supresory. Nicméně se ukazuje, že jejich zvýšená aktivita souvisí s mnoha typy rakovinného bujení. FOXO proteiny působí jako regulátory buněčné homeostáze, zvyšují odolnost nádorů vůči chemoterapii a podporují jejich růst. Cílem tohoto projektu je vyvinout specifické inhibitory schopné vázat se na DNA-vazebnou doménu, zkráceně DBD (z angl. DNA-binding domain, residua 156-269), FOXO3 a znemožnit tak její vazbu na DNA. Vývoj specifických inhibitorů FOXO3 vyžaduje znalost struktury DBD všech FOXO proteinů a detailní znalost jejich interakce s DNA. Doposud jsou známy struktury komplexů DNA s DBD FOXO1, FOXO3, FOXO4 a struktury volných DBD FOXO3 a FOXO4. V této práci byla vyřešena struktura volné DBD FOXO1. V předchozí práci byla studována sloučenina S9, která...
|
|
|
Regulation of transcription by proteins of the Early growth response and Myb families
Čermák, Vladimír ; Dvořák, Michal (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent) ; Elleder, Daniel (oponent)
Regulace transckripce desítek tisíc genů v organizmu obratlovců je mimořádně komplexním fenoménem, jehož se účastní tisíce různých regulačních proteinů. Největší funkční kategorií těchto regulátorů jsou sekvenčně specifické DNA vazebné proteiny známé jako transkripční faktory. Proteiny z EGR a Myb rodin transkripčních faktorů jsou relativně dlouho zkoumanými regulátory různých fyziologických procesů, včetně buněčné proliferace a diferenciace. Zatímco strukturální a fyzikální aspekty jejich funkce byly dobře charakterizovány, jejich buněčně specifická role v komplexních genově regulačních sítích není dostatečně prostudována a představuje hlavní výzvu v příslušných oblastech výzkumu. Předběžná analýza dat genové exprese z metastázujících buněk PR9692 a nemetastázujících buněk PR9692-E9 (kuřecích sarkomové linie) odhalila, že transkripční faktor EGR1 je syntetizován v relativně větším množství v metastázujících buňkách a může se tak podílet na regulačních procesech, které jsou základem rozdílů mezi oběma buněčnými liniemi. Dalším zkoumáním jsme zjistili, že cílené zvýšení hladiny EGR1 v PR9692-E9 buňkách obnovuje jejich metastatický potenciál na úroveň PR9692 buněk. Mikročipová analýza takových buněk odhalila aktivaci genů, které jsou rozhodující pro kontraktilitu aktinového cytoskeletu (MYL9),...
|
|
|
Transkripční faktory CSL a jejich role v kvasince Schizosaccharomyces pombe
Oravcová, Martina ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Proteiny rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ/Suppressor of Hairless/LAG-1) působí v organismech říše Metazoa jako efektory signální dráhy Notch. V rámci této signalizace fungují jako represory nebo aktivátory transkripce genů a ovlivňují mnoho vývojových procesů. Metazoální proteiny CSL mohou regulovat expresi genů také nezávisle na Notch. Funkce proteinů CSL nezávislé na Notch by mohly být evolučně původní a pro buňku a organismus mohou být neméně důležité jako funkce dependentní na Notch. Přítomnost proteinů CSL byla zjištěna i u některých organismů říše Fungi, které postrádají komponenty signální dráhy Notch a většinu známých metazoálních interakčních partnerů proteinů CSL. Paralogy CSL poltivé kvasinky Schizosaccharomyces pombe, cbf11 a cbf12, jsou neesenciální geny kódující proteiny lokalizované v jádře buňky. Oba se antagonistickým způsobem zapojují do regulace procesů jako například koordinace jaderného a buněčného dělení a průchodu buněčným cyklem, udržování ploidie, adhezivity buněk a dalších. V této práci jsme prokázali, že oba paralogy CSL mají schopnost sekvenčně specificky vázat kanonický CSL-responzivní element DNA in vitro a Cbf11 také in vivo. Oba proteiny mohou aktivovat genovou expresi in vivo, a vykonávat tak funkci transkripčních faktorů. Pomocí metody ChIP-chip jsme analyzovali vazbu...
|
|
|
Regulation of transcription in mycobacteria.
Páleníková, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Mrvová, Silvia (oponent)
Bakteriálna bunka sa musí vedieť rýchlo prispôsobiť zmenám, ktorým je vystavená v prostredí. Na tieto zmeny reaguje reguláciou génovej expresie primárne na úrovni iniciácie transkripcie. Medzi formy reguláciu transkripcie môžeme zaradiť rôznu stavbu promótorových oblastí pred odlišnými skupinami génov, prítomnosť alternatívnych sigma faktorov a tiež ovplyvňovanie priebehu génovej expresie pôsobením transkripčných faktorov buď ako aktivátory, alebo ako inhibítory. V tejto práci sú popísané spôsoby regulácie transkripcie u baktérií rodu Mycobacterium, ku ktorým zahrňujeme aj patogénne baktérie M. tuberculosis a M. leprae. Baktérie tohto rodu vykazujú malú konzervovanosť promótorových oblastí, veľké množstvo sigma faktorov, veľký počet transkripčných faktorov, prítomnosť dvojkomponentových systémov a mnoho, zatiaľ málo preskúmaných, malých regulačných RNA.
|
host ::
RSS.