|
|
Studium mechanismů regulace vybraných proteinkinas
Petrvalská, Olívia ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Jiráček, Jiří (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Proteiny 14-3-3 skrze vazbu více než 300 vazebných partnerů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci této disertační práce byla studována úloha proteinů 14-3-3 v regulaci dvou vybraných proteinkinas ASK1 a CaMKK2. Hlavním cílem práce bylo pochopit strukturní podstatu mechanismů, kterými fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 regulují aktivitu těchto proteinkinas pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména metod bodové mutagenese, měření enzymové aktivity, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření, chemického zesítění, nukleární magnetické rezonance a fluorescenční spektroskopie. Na základě získaných dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění byl navrhnut model struktury komplexu katalytické domény proteinkinasy ASK1 s proteinem 14-3-3ζ, který ukazál, že tento komplex je v roztoku konformačně heterogenní. Tento strukturní model společně s daty z časově rozlišené fluorescence a nukleární magnetické rezonance částečně vysvětlují inhibiční mechanismus proteinu 14-3-3. Získané výsledky ukázaly, že protein 14-3-3ζ interaguje s katalytickou doménou ASK1 v těsné blízkosti aktivního místa, a proto by tato interakce mohla mít vliv na strukturu nebo...
|
|
|
Úloha protein-proteinových interakcí v regulaci signálních proteinů a enzymů
Košek, Dalibor ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Karpenko, Vladimír (oponent) ; Pompach, Petr (oponent)
CZ Mezi všemi způsoby regulace signalizace mají protein-proteinové interakce přednostní postavení. Jejich studium v různých podmínkách je logickým a důležitým krokem v pochopení molekulárního mechanismu funkcí jednotlivých regulačních procesů. Tato práce je zaměřena na studium tří takových procesů: ASK1 proteinkinasa, důležitý iniciátor proapoptotických dějů, je za fyziologických podmínek udržována v neaktivním stavu v komplexu s proteinem 14-3-3 a TRX1. Za podmínek oxidačního stresu však tyto proteiny disociují a proteinkinasa se stává aktivní. Dalším procesem je interakce proteinu 14-3-3 s fosducinem a studium jeho úlohy v negativní regulaci G proteinové signalizace v rámci biochemie zraku. Třetí proces je aktivace Nth1 prostřednictvím interakce s Bmh1 a vápníkových kationů. Práce si klade za cíl pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména bodové mutageneze, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření a fluorescenční spektroskopie přispět k objasnění strukturní podstaty výše popsaných dějů a vysvětlit úlohu protein-proteinových interakcí v jejich regulaci. Na základě výsledků získaných těmito metodami byly zjištěny strukturní informace o tvaru a stechiometrii komplexů TRX1 i proteinu 14-3-3 s odpovídajícími vazebnými doménami ASK1 včetně jejich...
|
|
|
Tandemová hmotnostní spektrometrie sfingolipidů s aplikací pro metabolické studie a diagnostiku sfingolipidos
Kuchař, Ladislav
V posledních letech se hmotnostní spektrometrie (MS) stala dominantní technologií používanou při lipidomické analýze a silně ovlivnila výzkum a diagnostiku onemocnění lipidního metabolismu jako např. lysosomální střádavá onemocnění (LSD) charakterisovaná poruchami funkcí lysosomů. Soubor poruch lysosomální degradace sfingolipidů (SFL) přísluší ke skupině sfingolipidos. Tento stav má vážné až fatální klinické důsledky. Prvotním cílem práce bylo zavedení kvantitativní a kvalitativní analýzy SFL pro výzkum a diagnostiku LSD. Na jejím počátku bylo třeba připravit semisynthesou lipidní hmotnostně značené standardy pomocí imobilizované sfingolipid ceramid N-deacylasy. Zavedené metody kvantitativní analysy byly posléze použity k průkazu zvýšené exkrece močových SFL u LSD s charakteristickým střádáním v ledvinách. Vyhodnocení SFL vylučovaných močí prokázalo svůj význam při diferenciální diagnostice deficitu prosaposinu a saposinu B kdy rutinní enzymologie selhává. MS navíc umožňuje sledování jednotlivých molekulárních druhů SFL (isoforem), jenž vedlo ke zjištění, že u některých LSD se jejich profil v moči mění. To následně vedlo k vývoji nové screeningové metody v suchém vzorku moče založeném na vyhodnocování profilu isoforem. Další aplikací MS byla analýza pitevních vzorků tkání nebo buněk u nevyjasněných...
|
|
|
Nutritional biology of synanthropic mites (Acari: Acaridida)
Erban, Tomáš ; Smrž, Jaroslav (vedoucí práce) ; Grubhoffer, Libor (oponent) ; Šustr, Vladimír (oponent)
NÁZEV DISERTAČNÍ PRÁCE Potravní biologie synantropních roztočů (Acari: Acaridida) ABSTRAKT V minulosti bylo provedeno několik pokusů o popsání potravní biologie akaroidních roztočů, nicméně plné porozumění těmto procesům pozbývá úplnosti. Cílem této disertační práce bylo rozšířit naše znalosti týkající se trávicí fyziologie skladištních a prachových roztočů a aplikovat tyto znalosti na jejich potravní biologii. Výzkumný přístup použitý v této disertační práci zahrnuje in vitro charakterizaci enzymové aktivity v celotělních extraktech (WME) a extraktech zbytkového růstového média (SGME), vyhodnocení enzymové aktivity s ohledem na fyziologické pH střeva, enzymatické inhibiční experimenty, in vivo lokalizaci enzymových aktivit ve střevě roztočů, určení efektů výživných nebo růst inhibujících aditiv v experimentálních dietách na populační růst roztočů a určení potravních preferencí synantropních roztočů na základě vyhodnocených in vitro a in vivo analýz. pH střeva dvanácti druhů synantropních akaroidních roztočů bylo determinováno v rozmezí pH 4 až 7 a ukázalo gradient v pH z předního do zadního střeva. pH v trávicím traktu synantropních akaroidních roztočů koresponduje aktivitám proteáz, α-glukosidáz, α-amyláz a bakteriolytických enzymů. Aktivita těchto enzymů reprezentuje hlavní trávicí aktivitu v roztočích,...
|
|
|
Tandemová hmotnostní spektrometrie sfingolipidů s aplikací pro metabolické studie a diagnostiku sfingolipidos
Kuchař, Ladislav ; Ledvinová, Jana (vedoucí práce) ; Stiborová, Marie (oponent) ; Holčapek, Michal (oponent)
V posledních letech se hmotnostní spektrometrie (MS) stala dominantní technologií používanou při lipidomické analýze a silně ovlivnila výzkum a diagnostiku onemocnění lipidního metabolismu jako např. lysosomální střádavá onemocnění (LSD) charakterisovaná poruchami funkcí lysosomů. Soubor poruch lysosomální degradace sfingolipidů (SFL) přísluší ke skupině sfingolipidos. Tento stav má vážné až fatální klinické důsledky. Prvotním cílem práce bylo zavedení kvantitativní a kvalitativní analýzy SFL pro výzkum a diagnostiku LSD. Na jejím počátku bylo třeba připravit semisynthesou lipidní hmotnostně značené standardy pomocí imobilizované sfingolipid ceramid N-deacylasy. Zavedené metody kvantitativní analysy byly posléze použity k průkazu zvýšené exkrece močových SFL u LSD s charakteristickým střádáním v ledvinách. Vyhodnocení SFL vylučovaných močí prokázalo svůj význam při diferenciální diagnostice deficitu prosaposinu a saposinu B kdy rutinní enzymologie selhává. MS navíc umožňuje sledování jednotlivých molekulárních druhů SFL (isoforem), jenž vedlo ke zjištění, že u některých LSD se jejich profil v moči mění. To následně vedlo k vývoji nové screeningové metody v suchém vzorku moče založeném na vyhodnocování profilu isoforem. Další aplikací MS byla analýza pitevních vzorků tkání nebo buněk u nevyjasněných...
|
|
|
Vliv působení uranu na metabolismus sacharidů kultivovaných rostlin.
Lábusová, Jana ; Lipavská, Helena (vedoucí práce) ; Lhotáková, Zuzana (oponent)
Znečištění životního prostředí těžkými kovy představuje v současné době velmi závažný problém celého světa. Radionuklidy, mezi něž patří uran, jsou těžké kovy způsobující jak chemické, tak radioaktivní znečištění. Přirozeně se vyskytující uran nepředstavuje pro živé organismy tak vysoké riziko. Až lidská činnost, hlavně těžba uranové rudy a používání fosfátových hnojiv, zvýšila jeho koncentraci v prostředí, a tím i rozsah znečištění. Specifikem České Republiky je výskyt bohatých nalezišť uranové rudy. Těžba po sobě zanechává veliké plochy kontaminované nejen uranem, ale i jinými těžkými kovy a xenobiotiky, které je potřeba z prostředí odstranit. Jednou z možností, jak půdu a vodu vyčistit, je fytoremediace. Tato ekologicky přívětivá a relativně levná technika využívá schopnosti rostlin přijímat, translokovat, transformovat a následně ukládat tyto látky. Pro plné využití této techniky je potřeba porozumět mechanismům obranné odpovědi rostlin na stres způsobený xenobiotiky. Proto jsem se v diplomové práci zaměřila na ovlivnění sacharidového metabolismu rostlin stresovaných uranem a jejich antioxidační mechanismus obrany. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Imobilizace proteasy V8 na magnetických částicích pro použití k proteolytickému štěpení pepsinu A
Čepa, Adam ; Pacáková, Věra (vedoucí práce) ; Tichá, Marie (oponent)
Tato bakalářská práce navazuje na dlouholetý výzkum v oblasti diagnostiky onemocnění žaludku, který je založen na mapování žaludečního enzymu pepsinu A. Bylo zjištěno, že určité fosforylace v primární struktuře tohoto enzymu mohou sloužit jako marker počínající karcinogenity. Tato bakalářská práce je zaměřena na imobilizaci proteasy V8 izolované z mikroorganismu Stafylococcus aureus na agarosových magnetických kuličkách. Proteasa V8 je vhodným kandidátem pro tvorbu peptidové mapy pepsinu A. Byl studován vliv pH, teploty a reakční doby na aktivitu enzymu a určeny optimální podmínky pro hydrolytickou katalýzu tvorby peptidických fragmentů pepsinu A.
|
|
|
ENZYMATICKÉ STUDIE TVORBY ORGANOHALOGENOVANÝCH LÁTEK POMOCÍ MODELOVÝCH SUBSTRÁTŮ
Blažková, Ivona ; Tesařová, E. ; Forczek, Sándor
Výzkum v posledních letech prokázal, že se halogenované organické látky tvoří v přírodě vlivem\nbiotických a biotických procesů. Jedním z nejznámějších zdrojů těchto látek jsou reakce\nkatalyzované haloperoxidázami, k nimž patří i chloroperoxidáza (CPO) izolovaná\nz Caldariomyces fumago. CPO enzym byl inkubován s chloridem či bromidem, v přítomnosti\nperoxidu vodíku a organických substrátů. Byly provedeny pokusy se třemi substráty (aceton,\nkyselina octová a glukosa) a s různými koncentracemi halidů. Měření vzorků plynovou\nchromatografií s ECD detektorem prokázalo vliv povahy substrátu i koncentrace halogenidů na\ntvorbu organohalogenovaných produktů.
|
|
|
Studium protektivního účinku 3-hydroxybutyrátu a jeho derivátů
Černá, Klára ; Smilek, Jiří (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem této bakalářské práce je studium chemických chaperonů, jakožto ochranných látek enzymů před denaturačními procesy. V experimentální části práce byly zkoumány protektivní účinky pěti vybraných potenciálních protektivních látek – derivátů 3-hydroxybutyrátu – na dvou modelových enzymech: lipáze a lysozymu. Protektivní účinky potenciálních chemických chaperonů byly zkoumány metodou dynamického rozptylu světla (DLS), kterou byla stanovována distribuce velikosti vznikajících agregátů lipázy v závislosti na teplotě při tepelně indukované denaturaci. Dále byla použita diferenciální kompenzační kalorimetrie (DSC), kterou byla stanovena teplota denaturace lysozymu v přítomnosti nebo nepřítomnosti potenciálně protektivních látek. Posledním parametrem bylo stanovení vlivu potenciálně protektivních látek při různých koncentracích na katalytickou aktivitu lipázy a stanovení residuální aktivity lipázy po aplikaci dvou denaturačních faktorů – zvýšené teploty a mražení. Ze všech testovaných strukturních analogů 3-hydroxybutyrátu byl nejvyšší protektivní efekt (stabilizace molekuly enzymu) pozorován u jantaranu, který disponuje dvěma karboxylovými skupinami. Naopak 1,3-butandiol nevykázal prakticky žádnou protektivní účinnost, což dokazuje, že přítomnost karboxylové skupiny je pro protektivní účinek zcela zásadní. Nízká protektivní účinnost butyrátu dále naznačuje, že je nezbytné, aby efektivní protektant kromě karboxylové skupiny obsahoval i další funkční skupinu – ať už karboxylovou nebo hydroxylovou. Výraznější protektivní účinek byl pozorován u 3-hydroxybutyrátu, než-li u 2-hydroxybutyrátu. Je zajímavé, že efektivní protektanty zároveň při vyšších koncentracích výrazně inhibují enzymovou aktivitu modelového enzymu, což pravděpodobně souvisí se solvatací a konformací proteinu v přítomnosti protektantů a dostupností aktivního místa pro substrát.
|
|
|
Microbial Degradation of Polycaprolactone-based Materials
Damborský, Pavel ; Stratilová, Eva (oponent) ; Hermanová, Soňa (vedoucí práce)
The thesis deals with the issue of the effect of nutritious factors and aeration on Bacillus subtilis (CCM 1999) lipase production, which was studied from the viewpoint of the crucial action of lipases on polyester chains degradation. The parameters such as bacterial growth, lipolytic activity, pH optimum, temperature optimum, thermal stability, proteolytic activity, the amount of proteins, etc. were determined in three types of media inoculated by Bacillus subtilis. One sample set of media: peptone and yeast extract (NB), medium consisted in peptone and yeast extract with the addition of 2% (w/v) glucose (NBG) and mineral solution with yeast extract (MS-YE) contained poly(-caprolactone), PCL film (Mn = 10 kDa, = 1.4). Experiments were performed for 21 days under shaking at 160 and 200 rpm. The presence of PCL caused in both types of media (NB, NBG) higher values of lipolytic activity of Bacillus subtilis indicating the participation of released low-molecular weight species as the products of PCL biodegradation. In BS-inoculated MS-YE medium low lipolytic activity of Bacillus subtilis as compared with those measured in NB and NBG media was determined even in the presence of PCL. During experiment pH value shifted from neutral (pH 7.0) to alkaline (pH 8.5 – 9.3) region for all types of media with and without PCL specimens. This fact indicates negligible pH changes in microenvironment due to the degradation products and/or metabolites. Lipolytic enzymes determined in supernatants free of bacterial cells have shown two pH optima in the presence of PCL, at pH 7 and 9. Lipase in the absence of polymer displayed optimum pH of 7. Measurement of thermal stability demonstrated that extracellular lipases as relative thermostable enzyme especially in the absence of polymer. The basic proteomic analysis by peptide mass fingerprint (PMF) of lipases produced by Bacillus subtilis at NBG medium after one week of cultivation was performed. The presence of proteins with molecular weight (19.3 kDa) close to that reported for lipases was verified through FPLC. Both SDS-PAGE and IEF-PAGE indicated presence of these proteins in both studied media (NBG vs. NBG/PCL). However, no differences have been found in the presence of PCL and no lipase was truly identified through MALDI-TOF mass spectrometry. The occurrence of degradation process in PCL samples was also documented by their gradual weight loss, which was seen in all media types as the synergic effect of lipase- and base-catalyzed ester bond scission. Model degradation study of PCL and its composite with graphene oxide (2.7 wt% GO) was performed in the presence of Bacillus subtilis in NBG medium at 30 °C and initial pH 7 for three weeks. The weight loss of PCL films gradually increased during whole degradation test up to 12 wt%. Degradation of PCL/GO composite proceeds slower as documented by maximum weight loss of 5.0 wt%. The similar character of elution curves of both PCL and its composite, determined by SEC analysis, indicated shifting to lower molecular region.
|
host ::
RSS.