|
|
Molekulárně-biologická diagnostika lidských polyomavirů
Ryšavá, Markéta
S lidskými polyomaviry se většina lidské populace setká v dětství, kdy je první infekce bezpříznaková či s mírnými symptomy. Tyto viry ovšem v lidském těle perzistují a reaktivují se nejčastěji při imunosupresi. S reaktivací JC viru je spojena progresivní multifokální encefalopatie. S BK virem je spojena hemoragická cystitida, která má za následek ztrátu aloštěpu při transplantaci ledviny. Přesnou diagnostikou lze viry včas detekovat a zmírnit poškození tkáně. Tato diplomová práce se zabývá biotechnologiemi, které lze při detekci virů využít se zaměřením na real-time PCR, která je v diagnostice virů zlatým standardem. Literární rešerše shrnuje základní informace o polyomavirech se zaměřením na lidské polyomaviry BKV a JCV. Shrnuje biotechnologické metody používané k detekci polyomavirů, jak v rámci rutinní diagnostiky, tak alternativní přístupy zahrnující biosenzory a CRISPR. Experimentální část práce zahrnuje návrh detekčního systému pro polyomaviry od in silico analýzy genomu, přes návrh potenciálních primerů, po teoretickou analýzu specificity. Praktická část práce pak porovnává účinnost a senzitivitu amplifikace dvou re-akčních směsí, kdy je jedna určena pro jednoduché systémy a druhá pro multiplexy. Dále zahrnuje testování vybraných aditiv PCR a stanovení citlivosti a parametrů validity testu reakční směsi vybrané pro vývoj PCR systému. Výsledky poukázaly, že detekce pomocí multiplex reakční směsi je dostatečně citlivá, jelikož splňuje podmínky a požadavky klinických doporučení a současně vykazuje velmi dobré hodnoty senzitivity a specificity testu srovnatelné s publikovanými technologiemi. Tato reakční směs se jeví jako relevantní k použití vývoje a optimalizaci PCR systému pro detekci polyomavirů.
|
|
|
Virom dolních močových cest
Cirbusová, Adéla ; Saláková, Martina (vedoucí práce) ; Španielová, Hana (oponent)
Lidský močový trakt byl dlouhou dobu pokládán za sterilní prostředí. V posledních letech se však ukázalo, že je osídlen rozmanitou mikrobiální komunitou, jejíž součástí jsou i viry. O viromu moči je toho ale prozatím známo jen velmi málo. V této práci byl virom močového traktu charakterizován u tří jedinců ze vzorků moči pomocí metodiky sekvenování nové generace (NGS), jež byla nejprve pro tento účel optimalizována. Charakteristika viromu ze vzorků moči pomocí NGS se však ukázala být poměrně problematická, což bylo zapříčiněno především fragmentací virových genomů. I přes to se podařilo u všech tří jedinců identifikovat lidské endogenní retroviry a u dvou z nich také JC polyomavirus. Složka viromu moči tvořená lidskými DNA viry byla dále blíže prozkoumána pomocí kvantitativní PCR. Možný rozdíl v zastoupení a virové náloži lidských DNA virů byl pozorován u pacientů s karcinomem močového měchýře (mm) a bez karcinomu mm a také v závislosti na části močového traktu, ze které byl vzorek odebrán. Nejvíce zastoupené viry byly Torque Teno virus a JC polyomavirus. Torque Teno virus byl detekován u 75 % pacientů s karcinomem mm a 60 % pacientů bez karcinomu, JC polyomavirus u 43,8 % pacientů s karcinomem mm a 50 % pacientů bez karcinomu. U 25 % pacientů s karcinomem mm a 20 % pacientů bez karcinomu se dále...
|
|
|
Targeting of viral nanoparticles to cancer specific receptors
Žáčková Suchanová, Jiřina ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent) ; Ulbrich, Pavel (oponent)
Úkolem této práce bylo prozkoumat potenciál umělých virových částic (virus-like particles, VLPs) odvozených od myšího polyomaviru (MPyV) jako možných nanonosičů pro řízenou dopravu terapeutických a diagnostických látek do specifických buněk či tkání. Vybrali jsme VLPs myšího polyomaviru, protože neobsahují virovou DNA a jsou považovány za bezpečné pro využití v bioaplikacích. Při našem výzkumu jsme použili přístup chemické modifikace pro přesměrování VLPs z jejich přirozeného receptoru na nádorové buňky. Lysinové zbytky exponované na povrchu částice byly modifikovány aldehydickým činidlem pro následnou konjugaci vybraných molekul, transferinu a inhibitoru glutamát karboxypeptidázy II (GCPII), na povrch částice. Transferin, transportér iontů železa do metabolicky aktivních buněk, pomohl k přesměrování VLPs do různých druhů nádorových buněk nadměrně produkujících transferinový receptor. Na druhou stranu, GCPII slouží jako transmembránový antigen specificky se vyskytující na buňkách nádoru prostaty a připojení malé molekuly inhibitoru k VLPs vedlo k úspěšnému rozpoznání těchto buněk. Použili jsme metodu elektronové mikroskopie k vizualizaci obou typů modifikovaných VLPs a metody průtokové cytometrie a konfokální mikroskopie pro studium specifických buněčných interakcí a internalizace nanočástic. Dále...
|
|
|
Příprava experimentálního systému pro studium životního cyklu myšího polyomaviru
Pergner, Jiří ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Mašek, Tomáš (oponent)
Příprava experimentálního systému pro studium životního cyklu myšího polyomaviru Abstrakt: Myší polyomavirus je modelovým zástupcem virové čeledi Polyomaviridae. Do této čeledi patří i některé významné lidské patogeny (BKV, JCV, Merkel cell polyomavirus). Díky některým svým vlastnostem viry z této čeledi mohou sloužit i jako vektory pro genovou terapii, nebo pro přípravu rekombinatních vakcín. Nové metodické přístupy mohou pomoci k porozumění dosud neznámých faktů ze životního cyklu myšího polyomaviru. Objasnění některých dějů životního cyklu může být důležité z hlediska možného využití polyomavirů pro terapeutické účely. Tato diplomová práce se zabývá přípravou dvou inovativních experimentálních systémů, které rozšiřují možnosti studia životního cyklu myšího polyomaviru. První část diplomové práce je zaměřena na přípravu rekombinantního myšího polyomaviru exprimujícího žlutý fluorescenční protein (EYFP) v časných fázích infekce. Takový virus může být vhodným nástrojem pro studium šíření infekce v živých buňkách metodami fluorescenční mikroskopie i průtokové cytometrie. Lze jej využít i pro studium kolokalizace nestrukturního proteinu velkého T antigenu s některými buněčnými proteiny. V druhé části diplomové práce je popsána příprava hybridní buněčné linie připravené fúzí myších a opičích buněk. Tato...
|
|
|
Příprava expresních vektorů a virových mutant pro studium minoritních strukturních proteinů polyomavirů
Cibulka, Jakub ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Šroller, Vojtěch (oponent)
Polyomaviry jsou malé neobalené DNA viry infikující ptáky a savce, včetně člověka. Jejich kapsida je tvořena hlavním kapsidovým proteinem VP1 a dvěma minoritními kapsidovými proteiny VP2 a VP3. Důležitou funkcí minoritních proteinů je pravděpodobně zprostředkování dopravy virového genomu do jádra buňky, aby mohlo dojít k úspěšné replikaci viru. Proteiny VP2 a VP3 myšího polyomaviru a viru SV40 mají schopnost vázat a perforovat buněčné membrány a má se za to, že právě tato jejich vlastnost pomáhá dopravit virový genom do jádra. V rámci této práce byly připraveny plasmidy pro produkci a vizualizaci minoritních kapsidových proteinů polyomaviru karcinomu Merkelových buněk v savčích buňkách. Tyto proteiny se svými sekvencemi výrazně liší od minoritních proteinů ostatních lidských polyomavirů i příbuzného myšího polyomaviru. Při jejich samostatné produkci v buňkách se ukázalo, že na rozdíl od proteinů VP2 a VP3 myšího polyomaviru nevykazují zřetelnou afinitu k membránám. Druhým cílem této práce byla příprava mutant myšího polyomaviru s delecemi v hydrofobních doménách proteinů VP2 a VP3, které by měly být zodpovědné za výše zmíněné membránové interakce. Tyto mutanty nebyly infekční, ale ztráta infektivity může souviset s celkovým ovlivněním produkce pozdních proteinů viru a nejen s funkcí těchto domén jako takových.
|
|
|
Minoritní strukturní proteiny polyomavirů: Vlastnosti a interakce s buněčnými strukturami
Vinšová, Barbora ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
I když jsou polyomaviry intenzivně zkoumány více než 60 let, stále není dostatečně objasněna role minoritních strukturních proteinů VP2 a VP3 v některých důležitých krocích životního cyklu viru, a to zejména jejich úloha při dopravení virového genomu do jádra a také jejich zapojení v pozdní fázi životního cyklu viru. Tato diplomová práce je zaměřena na studium minoritních proteinů Myšího polyomaviru (MPyV) a lidského polyomaviru BK (BKV). V rámci této práce byly připraveny čtyři králičí polyklonální protilátky proti minoritním proteinům virů MPyV nebo BKV. Dvě připravené protilátky jsou namířeny proti minoritním proteinům MPyV (α-MPyV VP2/3) nebo BKV viru (α-BKV VP2/3) a další dvě připravené protilátky rozeznávají společnou C-koncovou sekvenci minoritních proteinů VP2 a VP3 MPyV (α-MPyV C-termVP2/3) nebo BKV viru (α-BKV C-termVP2/3). V druhé části práce jsme se zaměřili na studium toxicity minoritních proteinů polyomaviru BKV při jejich samostatné produkci v savčích buňkách. Získaná data naznačují, že v porovnání s minoritními proteiny VP2 a VP3 viru MPyV, nevykazují minoritní proteiny BKV viru tak vysokou míru cytotoxicity. Třetí část práce je věnována studiu interakcí minoritních proteinů polyomavirů BKV a MPyV s buněčnými proteiny a mezi sebou navzájem. Pomocí připravených protilátek byly...
|
|
|
Vesikulární transport z kyselých endosomálních kompartmentů do endoplasmatického retikula
Polidarová, Markéta ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Plocek, Vítězslav (oponent)
Retrográdní transport z endozomů do Golgiho aparátu a dál do endoplasmatického retikula slouží buňkám pro opětovné využití receptorů a dalších proteinů. Existuje řada drah začínající na různých typech endozomů cílená do trans-Golgi síťoviny a z ní dál do endoplasmatického retikula. Z časných a maturujících endozomů jsou proteiny transportovány pomocí retromeru, pro pohyb z pozdních endozomů je zásadní GTPáza Rab9 a v transportu z recyklujících endozomů se uplatňují Rab6 a Rab11. V rámci Golgiho aparátu jsou známé dvě dráhy. Jedna pomocí COPI váčků regulovaná GTPázou Arf1, která je citlivá k brefeldinu A. Druhá dráha je regulována GTPázou Rab6. Retrográdní transport využívají kromě endogenních proteinů také proteinové toxiny a malé neobalené DNA viry. Pro Shiga toxin je charakteristické využívání Rab6 dráhy z recyklujících endozomů i přes Golgiho aparát. Retrográdní transport ricinu začíná na časných endozomech a je méně jasný. Transport malých neobalených DNA virů začínají vědci teprve poodkrývat.
|
|
|
Histonové modifikace a methylace polyomavirových genomů v průběhu infekce
Mrkáček, Michal ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Šmahelová, Jana (oponent)
Podobně jako všechny ostatní viry tak i polyomaviry vyžadují pro svou úspěšnou reprodukci proteiny a enzymy kódované jejich hostitelskými buňkami. Kromě toho, vzhledem k jejich relativně malému genomu s pouze několika geny, využívají polyomaviry pro co nejefektivnější zajištění své replikace i regulační mechanismy infikovaných buněk. Jednou z těchto regulací jsou posttranslační modifikace histonů, které tvoří nukleosomy na virové DNA. Spektrum těchto modifikací je velice široké, ale ve vztahu k polyomavirům jsou prozkoumány téměř výhradně jenom acetylace a methylace histonů. Druhou možnou regulací jsou methylace cytosinu v tzv. CpG dinukleotidech, která je spojována s potlačením genové exprese. Současné poznatky však naznačují, že tuto modifikaci polyomaviry příliš nevyužívají, ba dokonce vzhledem k neobvykle nízkému výskytu CpG dinukleotidů v jejich genomech se jí spíše vyhýbají. Cílem této práce je popsat jednotlivé typy těchto modifikací a poukázat na jejich možný význam v infekčním cyklu polyomavirů. Klíčová slova: polyomavirus, epigenetika, modifikace histonů, methylace DNA, CpG dinukleotidy
|
|
|
Nekódující kontrolní oblast genomu lidských polyomavirů
Pešek, David ; Saláková, Martina (vedoucí práce) ; Váňová, Jana (oponent)
Genom lidských polyomavirů sestává přibližně z 5000pb kruhové dvouřetězcové DNA a je rozdělován na tři funkční oblasti - časnou oblast (early viral gene region, EVGR) kódující regulační T antigeny a virové miRNA, nekódující kontrolní oblast (noncoding control region, NCCR) obsahující minimální cis-působící regulační sekvence, které jsou potřebné pro správný průběh virové replikace a pozdní oblast (late viral gene region, LVGR), který je zodpovědný za produkci strukturních kapsidových proteinů. Nekódující kontrolní oblast obsahuje minimální počátek replikace, který se vzájemně překrývá s promotory pro časnou i pozdní transkripci. Sekvence nekódující kontrolní oblasti zahrnují velké množství vazebných míst pro buněčné transkripční faktory, které mají schopnost regulovat expresi z LVGR a EVGR. V této práci byla popsána organizace nejvariabilnější oblasti polyomavirového genomu, NCCR, u polyomavirů SV40, BKPyV a JCPyV. V nekódující kontrolní oblasti často dochází k přestavbám, delecím, a dokonce i k bodovým mutacím, které mají dopad na expresi polyomaviru. Klíčová slova: polyomaviry, nekódující kontrolní oblast, BKPyV , JCPyV , SV40, velký T antigen, buněčné transkripční faktory
|
|
|
Studium účinku modifikace virových částic polyhistidinem na jejich intracelulární lokalizaci a dopravu genů do jádra
Číhařová, Barbora ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Grantz Šašková, Klára (oponent)
Virové vektory odvozené od myšího polyomaviru jsou vhodným nástrojem pro studium přístupů, které se používají v nanomedicíně pro dosažení efektivního přenosu terapeutických látek do buněk, do míst jejich cílového účinku. Vektory odvozené od myšího polyomaviru jsou stejně jako mnohé nanočástice často zachyceny v endosomu a následně degradovány. Diplomová práce se proto zabývá možností modifikace takovýchto vektorů, která by zajistila efektivnější přenos do cytosolu či až do jádra. Tato práce přinesla poznatky o zefektivnění přenosu částic modifikovaných pomocí membránově aktivních peptidů kovalentně vázaných ke kapsidovému proteinu VP3 lokalizovanému uvnitř částice. Pro kovalentní genetické modifikace VP3 proteinu byl využit polyhistidinový peptid KH27K a jeho potenciál ke zvýšení efektivity transdukce modifikovaných virových částic byl srovnáván s modifikací pomocí peptidů LAH4 nebo R8. Výsledky transdukčního testu ukázaly, že kovalentně navázaný peptid R8 je schopen proti nemodifikovaným částicím několikanásobně zvýšit účinnost dopravy do jádra. Modifikace LAH4 se naopak ukázala být účinnou pouze v případě, kdy byly částice s LAH4 asociovány pouze nekovalentně, v takovém případě byl přenos do jádra proti kontrolním částicím až 40- násobně efektivnější. Modifikace polyhistidinem, který by měl dle...
|
host ::
RSS.