|
|
Polyomavirové minichromozomy: interakce se složkami vrozené imunity
Satratzemis, Christos ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Trejbalová, Kateřina (oponent)
Genom polyomavirů má podobu kruhové dsDNA (double-stranded DNA), která je ve virionech a během celého replikačního cyklu v komplexu s buněčnými histony. Komplex polyomavirové DNA s histony je tak vzhledem ke strukturní podobnosti s chromatinem eukaryot označován jako minichromozom. Stav chromatinu minichromozomu ovlivňuje transkripci a replikaci virové DNA, což by mohlo být využito vrozenou imunitní odpovědí buňky na virovou infekci. Složkou vrozené imunity, jež působí na virový chromatin, je nekanonický histon H3.3, jeho chaperon DAXX-ATRX (death domain associated protein 6-alpha-thalassemia, mental retardation X-linked syndrome) a proteinové komplexy zvané PML (promyelocytic leukemia protein). Pro indukci vrozené imunitní reakce je však nutná detekce molekul signalizujících infekci či buněčný stres. Během infekce myším polyomavirem (MPyV) je reakce spouštěna DNA senzorem cGAS (cyclic GMP-AMP synthase). V této diplomové práci byla sledována distribuce histonu H3.3, chaperonového komplexu DAXX- ATRX a proteinu PML v průběhu infekce MPyV. Histon byl posléze ve virovém chromatinu detekován hmotnostní spektrometrií. Data naznačují, že chaperonový komplex a protein PML by se mohly podílet na regulaci vkládání H3.3 do chromatinu MPyV. Pro další studium senzoru cGAS byl konstruován plazmid kódující...
|
|
|
Interakce struktur polyomavirů se složkami buněčné vrozené imunity
Portychová, Tereza ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Schreiberová, Lucie (oponent)
Tématem této práce jsou poznatky o interakcích struktur polyomavirů se složkami vrozené imunity v infikovaných buňkách. Práce je soustředěna na modelové polyomaviry SV40 a MPyV a lidské BKPyV, JCPyV a MCPyV. Studium vzájemného působení mechanismů vrozené buněčné imunity a polyomavirových struktur je v začátcích. Infekce všemi uvedenými viry indukuje prostřednictvím virového časného LT antigenu odpovědi na poškození DNA (DDR; DNA damage response) nutné pro účinnou virovou replikaci. Poškození DNA může však aktivovat jak kanonicku, tak nekanonicku dráhu indukce interferonové produkce, která vede k antivirovému stavu. Polyomaviry se zdají být rozpoznány imunitním systémem až během replikace jejich genomů v buněčném jádře. Prozatím bylo prokázáno, že indukce interferonu polyomaviry může být zahájena DNA sensorem cGAS a dále aktivací STING (kanonická dráha), ale také po rozpoznání virové RNA proteinem RIG-I. Časné virové LT a st antigeny a pozdní agnoprotein některých polyomavirů prokázaly potenciál regulovat odpovědi vrozené buněčné imunity a ovlivnit tak navození persistence polyomavirů. Klíčová slova: polyomaviry, vrozená buněčná imunita, velký T antigen, malý t antigen, agnoprotein, geny stimulované interferonem
|
|
|
Buněčné faktory potlačující v hostitelských buňkách infekci myším polyomavirem: Studie PML proteinových izoforem
Anderová, Karolína ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Promyelocytární leukemická jaderná tělíska (PML NBs) jsou multifunkční jaderné sférické struktury tvořené schránkou PML proteinů a dalšími interakčními partnery, které byly popsány v mnoha buněčných procesech i imunitní obraně. Při antivirové imunitní odpovědi působí PML NBs a jejich komponenty jako přímé restrikční faktory i v rámci regulace interferonové odpovědi. Viry zároveň vyvinuly antagonistické mechanismy, jak se této inhibici bránit. Tato práce se zabývá rolí PML NBs při infekci modelovým myším polyomavirem (MPyV) a zaměřuje se na studium izoforem PML proteinu. Prvním cílem práce byla analýza tvorby lidských (hPML) i myších (mPML) NBs v modelu myších embryonálních fibroblastů (MEF). Následně byla zjišťována lokalizace hPML i mPML NBs při infekci. Pro oba druhy byla pozorována lokalizace v těsné blízkosti center replikace virových genomů. V dalším kroku byl testován vliv infekce nebo interferonu α (IFNα) na expresi mPML proteinů. Infekce i ošetření IFNα vedlo k nárůstu exprese mPML na úrovni genové transkripce i syntézy proteinů. Data současně naznačovala největší zvýšení transkripce pro izoformu mPML3. Práce se dále zabývala potenciální restrikční rolí izoformy mPML2. Výsledná data nicméně nenaznačovala, že by nadprodukce mPML2 proteinu infekci signifikantně ovlivňovala. V poslední části...
|
|
|
Studium vlastností virových kapsidových proteinů a vývoj rekombinantních vakcín a diagnostických komponent založených na umělých virových strukturách
Fraiberk, Martin ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Hubálek Kalbáčová, Marie (oponent) ; Hejnar, Jiří (oponent)
Cílem této studie bylo vytvořit systém pro snadnou produkci různých veterinárních chimérických vakcín založených na stabilních strukturách myšího polyomaviru (MPyV). Systém je určen pro antigeny, které jsou problematické z hlediska produkce nebo stability. Nejprve byly navrženy univerzální vektory pro bakulovirovou produkci chimérických, viru podobných částic (VLPs) nebo pentamer založených na hlavním kapsidovém proteinu VP1 MPyV, k jejich využití jako vakcíny proti jiným patogenům. Různé strategie použité v této studii jsou založené na: A) vystavení vybraných imunogenních epitopů na povrchu VLPs MPyV jejich inzercí do povrchové smyčky proteinu VP1, B) inzerci cizorodých peptidů a proteinů dovnitř VLPs nebo C) fúzi cizorodého proteinu nebo jeho částí s C-koncem proteinu VP1, a tedy vytvoření pentamer chimérického proteinu. Kandidátní vakcinační antigeny proti prasečímu cirkoviru typu 2 (PCV2), původci systémových chorob spojených s PCV2 (PCV2-SD), který způsobuje významné ekonomické ztráty v chovech prasat, byly připraveny pomocí zkonstruovaných vektorů. Všechny kandidátní vakcíny byly po imunizaci myší schopny indukovat produkci protilátek proti kapsidovému proteinu PCV2. Kandidátní vakcína VarC založená na fúzním kapsidovém proteinu MPyV a PCV2 dokázala indukovat produkci protilátek s nejvyšší...
|
|
|
Studium vlastností genových produktů Polyomaviru karcinomu Merkelových buněk : Příprava protilátek a konstrukce expresních vektorů.
Sauerová, Pavla ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Polyomavirus karcinomu Merkelových buněk (MCPyV) je relativně nedávno objevený lidský virus, jehož genom je často klonálně integrován v genomu karcinomových Merkelových buněk. Tento typ karcinomu se sice nevyskytuje zcela běžně, ale je velice agresivní a jeho incidence v posledních letech vzrůstá. Proto je tento virus středem vědeckého zájmu, ostatně tak jako většina patogenů či mechanismů, které působí na zdraví člověka. Virus byl objeven nedávno, proto je jeho výzkum na počátku. Tato diplomová práce se pokusila alespoň částečně přispět ke studiu tohoto patogenu z pohledu molekulární virologie. V této práci byla připravena neutralizační monoklonální protilátka typu IgG2a namířená proti hlavnímu kapsidovému proteinu VP1 MCPyV, která rozeznává konformační epitop VP1. Protilátka byla použita k pilotní studii pohybu VP1 VLPs MCPyV v savčích buňkách. Tato studie ukázala zřetelně, že virus využívá, alespoň částečně, ke svému pohybu buňkou váčků nesoucích caveolin-1 (byla pozorována kolokalizace VP1 VLPs s caveolinem-1). Sporadicky byla zaznamenána kolokalizace VP1 VLPs s markerem časného endozómu EEA1, markerem pozdního endozómu LamP2 a s markerem endoplazmatického retikula BiP. Tyto předběžné výsledky pozorování naznačují, že MCPyV virus by mohl využívat endocytickou dráhu vedoucí přes časný a pozdní...
|
|
| |
|
|
Studium pohybu polyomavirů z pozdního endozómu směrem k buněčnému jádru
Štach, Martin ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Němečková, Šárka (oponent)
Myší polyomavirus (MPyV) je modelovým virem čeledi Polyomaviridae. Polyomaviry jsou malé neobalené DNA viry. U imunosuprimovaných pacientů způsobují vážné problémy. Je znám jejich onkogenní potenciál u zvířat i u lidí. Transport MPyV v buňce stále není úplně objasněn. Virus vstupuje hladkými monopinocytickými váčky, pokračuje do časných a pozdních endozomů. Odtud je transportován do ER zatím neznámým mechanismem. Vyhýbá se Golgiho aparátu (GA). Možná cesta z pozdních endozomů je zprostředkovává GTPázou Rab9 do trans-Golgi síťoviny (TGN) a poté COPI váčky do ER. Výzkum, zdali MPyV využívá tuto dráhu na cestě do ER, v minulosti ukazoval různé výsledky. V této práci byl zkoumán účinek inhibitorů retrográdního transportu (Brefeldinu A, Golgicidu A) na infekci MPyV. Brefeldin A není zcela specifický, má vliv na celý endozomální systém. Golgicid A specificky rozrušuje transport přes TGN a GA. Oba inhibitory infekci MPyV inhibovaly. Konfokální mikroskopií bylo zjištěno, že část populace virionů kolokalizuje během jejich transportu k jádru s markery TGN a COPI váčků. MPyV nekolokalizoval s markerem cis-Golgi. Bohužel nebyl zjištěn vliv exprese dominantně negativní mutanty Rab9 na MPyV infekci, pro její vysokou cytotoxicitu. Avšak nadprodukce divokého typu Rab9 infekci usnadňovala. Výsledky podporují...
|
|
|
Nový chimérický antigenní receptor (CAR) pro terapii infekce lidským cytomegalovirem (HCMV)
Kroutilová, Marie ; Němečková, Šárka (vedoucí práce) ; Forstová, Jitka (oponent)
Lidský cytomegalovirus (HCMV, Herpesviridae) může způsobit vážné komplikace infikovaným pacientům podstupujícím transplantaci krvetvorných buněk. V současné době jsou pacienti léčeni antivirotiky nebo jsou využívány HCMV-specifické T lymfocyty seropozitivního dárce štěpu. V této práci byla zkoumána možnost zacílení HCMV-nespecifických T lymfocytů seronegativního dárce na HCMV-infikované buňky pomocí chimérického antigenního receptoru (CAR), tj. uměle zkonstruovaného receptoru pro T lymfocyt. Jako cíl pro tento receptor byl vybrán virový glykoprotein B (gB). Pro konstrukci CAR proti gB (gBCAR) byla použita publikovaná sekvence jednořetězcového variabilního fragmentu lidské protilátky. Po ověření produkce a povrchové lokalizace v buněčných liniích byl gBCAR vnášen do lidských T lymfocytů pomocí lentivirových vektorů. Jako cílové buňky byly použity lidské embryonální fibroblasty (LEP) infikované HCMV, u kterých byla prokázána povrchová exprese gB. Funkčnost gBCAR byla ověřena inkubací modifikovaných T lymfocytů s infikovanými buňkami a následnou analýzou média pro zjištění koncentrace IFNγ, která byla signifikantně vyšší u gBCAR T lymfocytů inkubovaných s HCMV-LEP oproti kontrolám. Dosažené výsledky ukazují specifitu gBCAR vůči HCMV-infikovaným buňkám a poskytují základ k dalšímu funkčnímu testování a...
|
|
|
Cytoskelet v pohybech myšího polyomaviru od povrchu buňky k buněčnému jádru
Klímová, Lucie ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Šmahel, Michal (oponent)
6 Roles of cytoskeleton in mouse polyomavirus trafficking ABSTRACT: Mouse polyomavirus (mPyV) is small non-enveloped DNA virus. Its endocytic pathway is studied for a potential utilisation of polyomaviral virus-like particles in gene therapy and/or immunotherapy. mPyV enter cells by internalisation into smooth monopinocytic vesicles. During it's journey through the cell, it pass through early endosomes, and at the time 3 hours post infection, it is localised in endoplasmic reticulum and recycling endosomes. Many aspects of mPyV trafficking and nuclear entry are not clear yet. Time-lapse live imaging fluorescence confocal microscopy was used to describe the mouse polyomavirus intracellular movements. For these studies, we utilised mPyV fluorophore-labeled virions and cells expressing GFP-tagged g-actin or alpha-tubulin. Some virion-loaded vesicles were seen to move with actin organised into dynamic structures. Some of these structures resembled actin comets created by Listeria or vaccinia virus. At the same time post infection (40-60 min post infection), movement of the virion loaded vesicles along mirotubules was observed suggesting the simultaneous involvement of actin and tubulin during mPyV trafficking. Dynamitin, a dominant negative inhibitor of dynein-dynactin function reduced mPyV infection. Taken...
|
|
|
Viry a jaderný cytoskelet
Cibulka, Jakub ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Šťovíček, Vratislav (oponent)
Jaderný cytoskelet (nukleoskelet) zajišťuje strukturní integritu jádra a účastní se řady klíčových procesů včetně transkripce, remodelace chromatinu nebo transportu mRNA. Je tvořen jadernými laminy, jaderným aktinem a dalšími proteiny. Některé viry replikující se v jádře využívají jaderný cytoskelet v některých fázích životním cyklu, v jiných případech naopak může představovat pro virovou infekci překážku. Herpesviry potřebují jaderný aktin ke skládání a transportu virových kapsid. V úniku z jádra jim však brání jaderná lamina, kterou musí rozrušit. U bakulovirů se jaderný aktin také podílí na správné morfogenezi kapsid a pravděpodobně i na jejich exportu z jádra. U některých retrovirů byl ukázán transport nesestřižených RNA z jádra pomocí jaderného aktinu a existují i důkazy o jimi indukované destrukci jaderné laminy. V této práci se podrobně zabývám interakcemi virů (výše zmíněných čeledí) s jaderným cytoskeletem (konkrétně s jaderným aktinem a laminy).
|
host ::
RSS.