|
|
Příprava expresních vektorů pro receptor NKp30 a jeho ligandy B7-H6 a BAG-6
Pažický, Samuel ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Milichovský, Jan (oponent)
NK buňky, buňky neadaptivního imunitního systému, jsou schopny za pomoci celé řady inhibičních a aktivačních receptorů rozeznat především virem infikované a nádorové buňky a následně je eliminovat. Pro NKp30, aktivační receptor NK buněk ze skupiny receptorů NCR (Natural Killer Cell Receptors), byla v poslední době identifikována několik ligandů, mezi které patří také membránový protein B7-H6 exprimovaný na nádorových buňkách a BAG-6, jaderný protein se širokým spektrem funkcí. Cílem mé bakalářské práce bylo připravit expresní vektory kódující receptor NKp30 a jeho ligandy B7-H6 a BAG-6, které by umožňovaly produkovat tyto proteiny v expresním systému HEK293. Klíčová slova: NK buňka, plasmid, receptor, NKp30, B7-H6, BAG-6
|
|
|
Strukturní biologie komplexu potkaních NK buněčných receptorů NKR-P1B a Clrb
Dvorská, Anna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
NK buňky mají důležitou roli v nespecifické imunitě organismů. Jejich schopností je rozpo- znat a zabít nádorové a virově infikované buňky bez předchozí senzitizace antigenem. Jejich funkce je usměrňována množstvím stimulačních a inhibičních receptorů interagujících s li- gandy na cílové - nádorové či infikované buňce. Tato práce se zabývá přípravou a studiem komplexu potkaního NK buněčného inhibičního receptoru NKR-P1B ("natural killer cell re- ceptor - protein 1B") a jeho ligandu Clrb ("C-type lectin-related ligand b"). Clrb spouští inhibici NKR-P1B, což znamená, že pokud buňka exprimuje Clrb, nebude zničena. Při in- fekci potkaním cytomegalovirem ztrácí buňka ze svého povrchu Clrb a není tedy zabráněno jejímu zničení. Buňky infikované tímto virem se brání zničení pomocí exprese virového genu C-lektinového typu RCTL, jenž je homologem Clrb. Pro rekombinantní přípravu rozpustné formy těchto dvou receptorů potkaních NK bu- něk byla použita tranzientní transfekce linie lidských embryonálních ledvinných buněk 293 s jednoduchou glykosylací (HEK293S GnTI− ). Nativní formy receptorů - disulfidicky vázané homodimery - byly připraveny jako fúzní konstrukty s IgG Fc (s pomocí vektoru pYD5), které po odštěpení TEV proteasou poskytují čistě dimerní formu extracelulární části re- ceptorů bez jakékoliv afinitní...
|
|
|
Příprava glykosylované formy lidského imunoreceptoru NKp30
Kalousková, Barbora ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
NK buňky (z angl. natural killer cells, přirozeně zabíječské buňky) hrají klíčovou roli v přirozené imunitě. Jejich úkolem je rozpoznávat a eliminovat infikované, stresované nebo maligně transformované buňky. K rozpoznání buněk slouží řada povrchových receptorů. Pro eliminaci buněk slouží cytotoxické mechanismy, které vedou k indukci apoptózy v cílové buňce. Jedním ze spouštěčů cytotoxické reakce je receptor NKp30, patřící společně s NKp46 a NKp44 do rodiny NCR (z angl. natural cytotoxicity receptors). Tato práce popisuje přípravu receptoru NKp30 s přirozenou i s jednoduchou glykosylací v expresním systému lidských embryonálních ledvinných buněk 293 (HEK293). Bylo zjištěno, že glykosylovaný receptor NKp30 tvoří nekovalentní oligomery. Mezi oligomery a monomery v roztoku se ustavuje rovnováha. Oligomerizace je závislá na glykosylaci, deglykosylovaný protein oligomery netvoří. Za účelem deglykosylace byla připravena rekombinantní endoglykosidasa ENDO F1.
|
|
|
Studium interakce lektinových receptorů přirozených zabíječů s jejich proteinovými ligandy.
Hernychová, Lucie ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
NK buňky jsou přirozené lymfocyty, které tvoří díky svému receptorovému systému první linii obrany organismu před infekcemi. Jsou důležitou součástí protivirové, ale také protinádorové imunity, hrají roli v transplantační imunitě, autoimunitě nebo reprodukci. Tato diplomová práce se zabývá studiem struktury membránového receptoru NKR-P1B myších NK buněk a jeho interakcí s ligandem Clr-b. Cílem bylo připravit expresní vektor kódující ligand-vazebnou a celou extracelulární část receptoru NKR-P1B a optimalizovat jeho produkci a renaturaci in vitro. Připravené proteiny byly analyzovány gelovou filtrací, elektroforeticky a hmotnostní spektrometrií. Poté byla sledována jejich interakce s proteinem Clr-b biofyzikálními (gelová filtrace a povrchová plazmonová rezonance) a biologickými metodami (značení buněčných preparátů proteiny NKR-P1B s navázanou fluorescenční sondou). In vitro vazebné pokusy nepotvrdily vzájemnou intarakci NKR-P1B a Clr-b, přestože se připravené proteiny vázaly na buňky z kostní dřeně.
|
|
|
Příprava lidského NK buněčného receptoru KACL
Nový, Jiří ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
NK buňky neboli přirození buněční zabíječi jsou důležitou součástí imunitního systému organismů. Jejich specifickou vlastností je to, že dokážou rozeznat a zneškodnit některé nádorové buňky a buňky infikované virem bez jakéhokoliv předchozího signálu. Jejich funkce je závislá na aktivitě povrchových stimulačních a inhibičních receptorů, které se aktivují interakcí s ligandy na povrchu cílových buněk. Interakce lidského NK receptoru NKp65 a ligandu KACL je velmi specifická, což potvrzuje velmi vysoká afinita interakce, která je oproti jiným příbuzným komplexům až 400× vyšší. O tomto komplexu je zatím známo jen málo informací, ale je jisté, že se účastní imunitních procesů v kůži, neboť KACL je produkován výhradně keranocyty. Náplní této bakalářské práce byla příprava rozpustné formy receptoru KACL za pomoci rekombinantní exprese proteinů v lidských embryonálních ledvinných buňkách s homogenní glykosylací (linie HEK293S GnTI- ). Protein byl následně charakterizován gelovou chromatografií a SDS elektroforézou. Správné zapojení čtyř cysteinů do dvou disulfidických můstků bylo ověřeno hmotnostní spektrometrií. S připraveným proteinem KACL bylo zahájeno strukturní studium metodou krystalizace proteinů.
|
|
|
Příprava expresních vektorů pro NKp65 a KACL, nových zástupců rodiny lidských NK buněčných receptorů
Mikulová, Barbora ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
NK buňky (natural killer cells, "přirození zabíječi") jsou významnou složkou vrozeného imunitního systému a mají schopnost rozpoznat a zabít především nádorové a virem infikované buňky. Na svém povrchu mají celou řadu inhibičních a aktivačních receptorů, pomocí kterých rozhodují o osudu cílových buněk. Imunitní odpověď je nejčastěji spuštěna po navázání NK buněčného receptoru na svůj ligand. Takovými receptor-ligandovými systémy jsou např. NKp80-AICL a NKRP1-LLT1 na lidských lymfocytech. Další receptor-ligandový pár představují NKp65 a KACL, dva nedávno objevené lektinové receptory lidských imunocytů. NKp65, blízký příbuzný NKp80, je glykoprotein, který funguje jako aktivační imunoreceptor na NK92MI buňkách. KACL je posledním objeveným členem lidské rodiny receptorů CLEC2 a je lokalizován téměř výhradně v kůži. Pomocí povrchové plazmonové rezonance bylo zjištěno, že NKp65 je vysokoafinitní receptor pro KACL. Cílem mé bakalářské práce bylo připravit expresní vektory kódující lidské NK buněčné receptory NKp65 a KACL, produkovat tyto proteiny v expresním systému HEK293T buněk a provést jejich purifikaci. Klíčová slova: NKp65, KACL, NK buňka, lektin, receptor, plazmid
|
|
|
Receptory NK buněk
Hernychová, Lucie ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Pavlů, Barbora (oponent)
NK buňky jsou důležitou součástí vrozeného imunitního systému, mají ovšem mnoho společných vlastností s imunokompetentními buňkami adaptivní imunity a mohou zároveň modulovat jejich činnost. Pomocí širokého spektra receptorů na svém povrchu rozpoznávají "cizí" molekuly (indukované především virovou nákazou či nádorovou transformací), jejich cílem jsou ale také struktury organismu vlastní, MHC glykoproteiny. Podle jejich množství na povrchu cílových buněk rozlišují, zda jsou tyto buňky infikované či transformované, pak indukují jejich apoptózu, nebo je vůči nim ustavena tolerance. Produkcí cytokinů a chemokinů též spouští zánětlivé odpovědi. Podle funkce lze rozdělit NK receptory do pěti skupin: aktivační, inhibiční, adhezivní, cytokinové a chemokinové. Na základě vazby příslušných ligandů na tyto receptory je buď spuštěna cytotoxická aktivita NK buňky, nebo je naopak inhibována. Funkce NK buněk je do jisté míry ovlivněna i mikroprostředím, ve kterém se právě vyskytují. Podle struktury se receptory NK buněk dělí na C-lektinové a imunoglobulinové. Do prvně zmíněné skupiny se řadí tři receptorové rodiny: Ly49, NKG2/CD94 a NKR-P1. Jsou to transmembránové proteiny typu II a převážně rozpoznávají MHC glykoproteiny. Mezi imunoglobulinové receptory patří rodiny KIR, LILR a NCR. Jedná se o transmembránové...
|
|
| |
|
|
Vliv polymorfismu NKR-P1 na expresi receptorů Ly49 u hybridních kmenů myší (C57BL/6 x Balb/c, F10-F12)
Holubová, Martina ; Fišerová, Anna (vedoucí práce) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Vliv polymorfismu NKR-P1 na expresi receptorů Ly49 u hybridních kmenů myší (C57BL/6 x Balb/c, F10-12) Abstrakt Přirozené zabíječské (NK) buňky tvoří subpopulaci velkých granulárních lymfocytů, které zprostředkovávají spontánní imunitní odpověď proti nádorovým a mikroorganismy infikovaným buňkám a představují tak důležitou součást vrozené imunity. Na povrchu NK buněk je exprimována široká škála aktivačních a inhibičních povrchových receptorů, jejichž prostřednictvím NK buňky rozpoznávají abnormální buňky; cytolytická aktivita je regulována na základě rovnováhy aktivačních a inhibičních signálů. K nejvýznamnějším rodinám receptorů myších NK buněk patří rodiny NKR-P1 a Ly49, které spadají do C-lektinové superrodiny receptorů kódované NK-genovým komplexem (NKC) na chromosomu 6 a zahrnují jak aktivační, tak inhibiční členy. Hlavním cílem této diplomové práce bylo ověřit vliv polymorfismu Nkr-p1c na expresi receptorů Ly49 a zjistit, zda se clustery genů Ly49 a Nkr-p1 lokalizované na opačných koncích NKC domény dědí nezávisle na sobě, či zda je na potomstvo přenášena celá NKC doména. Dalším cílem bylo zmapovat vliv zmíněného polymorfismu na cytotoxicitu NK buněk a růst nádorů. Pro tento účel byly použity myši inbredních kmenů C57BL/6 a Balb/c a jejich hybridi 10.-12. dceřinné generace. Genomy myší zmíněných kmenů...
|
|
|
Rekombinantní příprava receptorů potkaních NK buněk v expresním systému HEK293T.
Celadová, Petra ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent)
NK buňky hrají důležitou roli v imunitní odpovědi proti nádorovým a virově infikovaným buňkám. Exprimují široké spektrum různých povrchových receptorů, mezi které patří také NKRP1. Jedná se o rodinu C-lektinových receptorů, která zahrnuje receptory jak s inhibiční, tak s aktivační funkcí. Poměrně nedávno byly pro některé molekuly z této rodiny nalezeny ligandy, které patří taktéž do nadrodiny C-lektinových receptorů . Jedná se mj. o potkaní Clr-b, fyziologický ligand pro NKRP1B. Bylo zjištěno, že inhibiční funkce receptorového komplexu NKRP1B-Clr-b může být nabourána proteinem potkaního cytomegaloviru RCTL, virové verze Clr-b, která slouží jako falešný ligand pro NK buňky. Cílem mé diplomové práce bylo klonování a příprava zmíněných C-lektinových receptorů v transientně transfekované HEK293T buněčné linii v suspenzní kultuře. Tento expresní systém umožňuje získat proteiny s uspokojivým výsledkem, a to v jejich nativní konformaci, čímž je odstraněna potřeba časově náročných a často bezvýsledných pokusů o renaturaci proteinů připravených pomocí bakteriálního expresního systému v E. coli. Úspěchu bylo dosaženo v případě Clr-b a NKRP1B receptorů potkaních kmenů WAG i SD. Proteiny byly purifikovány za pomoci chelatační chromatografie následované gelovou filtrací, identifikovány hmotnostní spektrometrií a...
|
host ::
RSS.