|
Differentiation of mesenchymal stem cells on fibrin assemblies supported by immobilized growth factors FGF2 and VEGF
Musílková, Jana ; Filová, Elena ; Kaplan, Ondřej ; Bačáková, Lucie
Bioartificial heart valves and vascular grafts prepared from decellularized tissues could be recellularized with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) that are able to differentiate into both smooth muscle cells and endothelial cells. MSCs differentiation is facilitated by sustained release of growth factors. In our study assemblies based on fibrin, fibrin with heparin, fibrin with adsorbed or covalently-immobilized vascular endothelial growth factor A165 (VEGF) or basic fibroblast growth factor (FGF-2) via binding to heparin attached to fibrin have been prepared and were evaluated for their stimulation of MSCs differentiation. We estimated the mRNA expression of endothelial marker CD31 (PECAM1), smooth muscle marker α-actin (ACTA2), osteoblast markers osteocalcin (BGLAP) and alkaline phosphatase (ALP). The gene expression was estimated using RT-PCR on days 1, 7 and 21 after seeding. The cell morphology and viability was evaluated by LIVE/DEAD staining. VEGF, both adsorbed and covalently bound, increased significantly the expression of smooth muscle marker α-actin. The mRNA expression of ACTA2 on day 7 and 21 raised more than 200 times in comparison to control samples (undifferentiated cells before seeding). The ACTA2 gene expression significantly exceeded the expression of all other evaluated genes at all time intervals. Moreover, on day 21, the late smooth muscle marker desmin (DES) was steeply rising in cells cultivated on assemblies containing heparin and covalently bound VEGF. The expression of osteocalcin was minimal. We conclude that fibrin assembly containing covalently bound VEGF is the most convenient for MSCs differentiation towards smooth muscle cells.
|
|
Moderní biomateriály pro regeneraci pojivových tkání
Hefka Blahnová, Veronika ; Filová, Eva (vedoucí práce) ; Maxová, Hana (oponent) ; Motlík, Jan (oponent)
Pojivové tkáně se typicky vyznačují velkým objemem mezibuněčné hmoty. Jejich hlavní funkcí je poskytovat mechanickou oporu a ochranu ostatním tělním orgánům. Tato práce je zaměřena na regeneraci tkáně kosti a chrupavky, potažmo osteochondrálního defektu. V rámci provedených experimentů byla sledována viabilita a diferenciace lidských kmenových buněk. V in vitro podmínkách byl testován PCL nosič s příměsí růstových faktorů, kolagenová pěna s biokeramikami, xenogenní kostní štěp s biomimetickými peptidy a titanový nosič s nanostrukturovaným povrchem. Vybraný bezbuněčný nosič byl následně implantován do osteochondrálního defektu králičího modelu, kde byla sledována míra regenerace poškozených tkání. In vivo byl hodnocen kolagenový nosič s příměsí PCL nanovláken a biokeramik obohacený o růstové faktory IGF-1, bFGF, TGFβ1 a BMP-2. Právě přídavek růstových faktorů se in vivo jevil jako ne příliš vhodný především z důvodu indukce patologické zánětlivé odpovědi. a to navzdory tomu, že v in vitro podmínkách vykazoval spíše pozitivní efekt. Rovněž biomimetické peptidové sekvence stimulovaly osteogenní diferenciaci lidských mezenchymálních kmenových buněk. V případě různých typů biokeramik kombinovaných s kolagenem i buňky reagovaly spíše na konkrétní kalcium fosfát, respektive hydroxyapatit, než na povrchové...
|
|
Diferenciace kmenových buněk na beta buňky, které produkují insulin
Leontovyč, Ivan ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Lukšan, Ondřej (oponent)
Kmenové buňky slinivky břišní jsou schopné se diferencovat na -buňky produkující inzulín. Tyto buňky by tudíž mohli být vhodným zdrojem pro buněčnou terapii diabetu. Cílem této diplomové práce byl výzkum účinků čtyř různých růstových faktorů (LIF, noggin, TGF- a BMP-2) na diferenciaci kmenových buněk slinivky břišní směrem k -buňkám. Pro analýzu buněk vzniklých diferenciací byly použity průkazné metody (RT-PCR, nepřímá imunofluorescence a statické inkubace).
|
|
Změny v angiogenezi placenty a jejich vliv na opožděný intrauterinní růst plodu
Kudějová, Alena ; Švandová, Ivana (vedoucí práce) ; Magner, Martin (oponent)
Jakékoli patologické změny během normálního vaskulárního vývoje placenty mohou mít kritický dopad na růst a vývoj plodu. Důležitou roli ve formování vaskulárního systému placenty hraje proliferace a diferenciace několika typů buněk. Mezi hlavní faktory účastnící se cévního vývoje placenty patří buněčné elementy (např. trofoblast, buňky stromatu, haemangiogenní progenitory), extracelulární matrix), růstové faktory a cytokiny (např. VEGF, PIGF, Ang-1,2 a bFGF). Parciální tlak kyslíku v placentě, dostupnost živin a průtok krve placentou mohou dále ovlivnit i vnější faktory. Placentární ischemie vedoucí ke zhoršení průtoku krve placentou je nejčastější příčinou intrauterinní růstové retardace (IUGR). Vznik a vývoj IUGR je pak důsledkem nedostatečného prodlužování, větvení a rozšiřování kapilárních smyček během formování terminálních klků placenty. Publikované studie porovnávající roli růstových faktorů ve fyziologických těhotenstvích a těhotenstvích komplikovaných IUGR nedávají jednoznačné výsledky. Tato práce se formou přehledného článku zaměřuje na literární data týkající se placentární angiogeneze a jejích změn při vzniku intrauterinní růstové retardace. Klíčová slova: placenta, angiogeneze, IUGR, těhotenství
|
|
Příprava, charakterizace a testování krevních derivátů pro aplikace v regenerativní medicíně
Sovková, Věra ; Amler, Evžen (vedoucí práce) ; Kolářová, Hana (oponent) ; Vránová, Jana (oponent)
Trombocytární přípravky jsou pro široké spektrum bioaktivních látek vhodným produktem pro využití jednak jako doplňku pro kultivaci buněk in vitro, ale mohou být též využity při přípravě buněčných i bezbuněčných nosičů v různých odvětvích regenerativní medicíny. Cílem této práce bylo připravit několik typů krevních derivátů. U těchto přípravků byly dále sledovány koncentrace vybraných bioaktivních molekul. Následně byly tyto přípravky testovány in vitro a to buď samostatně nebo v kombinaci s nanovlákennými nosiči připravenými pomocí elektrostatického nebo odstředivého zvlákňování. Bylo zjistěno, že trombocytární přípravky obsahují v nejvyšších koncentracích chemokin RANTES a růstový faktor PDGF. Dále byl zjištěn obsah pro a protizánětlivých interleukinů a dalších růstových faktorů. Trombocytární lyzát je v 7% koncentraci schopen nahradit FBS v kultuře fibroblastů a keratinocytů. V dalších experimentech byly na nosiče připravené elektrostatickým i odstředivým zvlákňováním adherovány různé koncentrace trombocytů. Bylo zjištěno, že takto připravené nosiče podporují proliferaci i viabilitu všech testovaných buněk a to dávkově závislým způsobem. V posledním experimentu byly připraveny jednotlivé složky trombocytárního koncentrátu. Ty byly charakterizovány a byl sledován jejich vliv na buněčné kultury....
|
|
Inzulinu podobné a jiné růstové faktory a nádory
Kučera, Radek ; Topolčan, Ondřej (vedoucí práce) ; Klimeš, Jiří (oponent) ; Šafarčík, Kristian (oponent)
Inzulinu podobné a jiné růstové faktory a nádory Insulin like and other growth factors and tumors Disertační práce Plzeň 2011 Mgr. Radek Kučera Shrnutí V posledních několika letech se velice často diskutuje vliv IGF a jejich vazebných proteinů na vznik a progresi nádorů. Již začátkem 80. let minulého století se objevily práce, které upozorňovaly na možnou spojitost zvýšené produkce inzulinu podobných růstových faktorů se zvýšeným výskytem nádorů. Cílem mé práce bylo podívat se na vztah inzulinu podobných růstových faktorů popř. jejich vazebných proteinů a nádorů z několika různých pohledů, zhodnotit jejich význam a pokusit se určit místo IGF a IGFBP v současné nádorové diagnostice. Práce samotná je rozdělena do dvou částí, do teoretické části a části praktické. V teoretické části jsem vysvětlil fungování systému IGF v našem organismu a dále se zaměřil na dosavadní zjištění role systému IGF u jednotlivých nádorových diagnóz. V praktické části, kterou jsem rozdělil na dva oddíly, jsem nejprve studoval velký soubor pacientů s různými nádorovými diagnózami, poté jsem se věnoval souboru žen s nádorem prsu. Teoretická část Inzulinu podobné růstové faktory (IGF, insulin-like growth factors) jsou peptidy, které se podílejí na řízení růstu, metabolismu, přežívání a diferenciaci buněk a jsou regulovány růstovým...
|
|
Inzulinu podobné a jiné růstové faktory a nádory
Kučera, Radek ; Topolčan, Ondřej (vedoucí práce) ; Klimeš, Jiří (oponent) ; Šafarčík, Kristián (oponent)
Inzulinu podobné a jiné růstové faktory a nádory Insulin like and other growth factors and tumors Disertační práce Plzeň 2011 Mgr. Radek Kučera Shrnutí V posledních několika letech se velice často diskutuje vliv IGF a jejich vazebných proteinů na vznik a progresi nádorů. Již začátkem 80. let minulého století se objevily práce, které upozorňovaly na možnou spojitost zvýšené produkce inzulinu podobných růstových faktorů se zvýšeným výskytem nádorů. Cílem mé práce bylo podívat se na vztah inzulinu podobných růstových faktorů popř. jejich vazebných proteinů a nádorů z několika různých pohledů, zhodnotit jejich význam a pokusit se určit místo IGF a IGFBP v současné nádorové diagnostice. Práce samotná je rozdělena do dvou částí, do teoretické části a části praktické. V teoretické části jsem vysvětlil fungování systému IGF v našem organismu a dále se zaměřil na dosavadní zjištění role systému IGF u jednotlivých nádorových diagnóz. V praktické části, kterou jsem rozdělil na dva oddíly, jsem nejprve studoval velký soubor pacientů s různými nádorovými diagnózami, poté jsem se věnoval souboru žen s nádorem prsu. Teoretická část Inzulinu podobné růstové faktory (IGF, insulin-like growth factors) jsou peptidy, které se podílejí na řízení růstu, metabolismu, přežívání a diferenciaci buněk a jsou regulovány růstovým...
|
|
Úloha růstových faktorů a cytokinů v regulaci meiotického zrání oocytů savců
Marcollová, Kateřina ; Procházka, Radek (vedoucí práce) ; Vávra, Jiří (oponent)
Rozmnožování je klíčové pro přežití druhu. Oocyty jsou ve folikulu blokovány v profázi I. meiotického dělení. Stimulací gonadotropiny folikul roste a oocyt získává kompetence. Vyloučení 1. polárního tělíska je znak obnovy dělení oocytu. V profázi I. je oocyt blokován vysokou hladinou cAMP, aktivující PKA, která fosforylací inhibuje MPF. NPR2 po vazbě CNP tvoří v granulózních buňkách cGMP, který difunduje do oocytu, kde inhibičně kompetuje s cAMP na PDE3A, čímž je udržován dostatek cAMP pro blokaci oocytu v profázi. LH a FSH vyplavené z hypofýzy spouští signální kaskádu, obnovující meiotické dělení. Syntézou AREG, EREG a BTC v somatických buňkách se aktivují EGFR a MAPK dráhy, které se podílí na snížení propustnosti mezerových spojů a snížení aktivity NPR2, čímž poklesne produkce i transport cGMP. Do oocytu difunduje méně cGMP a aktivuje se PDE3A, hydrolyzující cAMP, díky čemuž se aktivuje MPF a obnoví se meiotické dělení. MAPK spolu s PI3K také zvyšují expresi Has2 a tím i produkci kyseliny hyaluronové, podílející se na expanzi kumulárních buněk a ovulaci oocytu. Využitím in vitro technik a kultivací oocytů s růstovými faktory a cytokiny, se zlepšuje zrání a růst oocytů, které vede ke kvalitnějším blastocystám. Médium FLI, kombinující FGF2, LIF a IGF-1, zvyšuje úspěšnost kultivace oocytů a kvalitu...
|
|
Příprava, charakterizace a testování krevních derivátů pro aplikace v regenerativní medicíně
Sovková, Věra ; Amler, Evžen (vedoucí práce) ; Kolářová, Hana (oponent) ; Vránová, Jana (oponent)
Trombocytární přípravky jsou pro široké spektrum bioaktivních látek vhodným produktem pro využití jednak jako doplňku pro kultivaci buněk in vitro, ale mohou být též využity při přípravě buněčných i bezbuněčných nosičů v různých odvětvích regenerativní medicíny. Cílem této práce bylo připravit několik typů krevních derivátů. U těchto přípravků byly dále sledovány koncentrace vybraných bioaktivních molekul. Následně byly tyto přípravky testovány in vitro a to buď samostatně nebo v kombinaci s nanovlákennými nosiči připravenými pomocí elektrostatického nebo odstředivého zvlákňování. Bylo zjistěno, že trombocytární přípravky obsahují v nejvyšších koncentracích chemokin RANTES a růstový faktor PDGF. Dále byl zjištěn obsah pro a protizánětlivých interleukinů a dalších růstových faktorů. Trombocytární lyzát je v 7% koncentraci schopen nahradit FBS v kultuře fibroblastů a keratinocytů. V dalších experimentech byly na nosiče připravené elektrostatickým i odstředivým zvlákňováním adherovány různé koncentrace trombocytů. Bylo zjištěno, že takto připravené nosiče podporují proliferaci i viabilitu všech testovaných buněk a to dávkově závislým způsobem. V posledním experimentu byly připraveny jednotlivé složky trombocytárního koncentrátu. Ty byly charakterizovány a byl sledován jejich vliv na buněčné kultury....
|
|
Adhesion and growth of adipose tissue-derived stem cells on fibrin assemblies with attached growth factors for tissue engineering of heart valves
Filová, Elena ; Trávníčková, Martina ; Knitlová, Jarmila ; Matějka, Roman ; Kučerová, Johanka ; Riedelová, Zuzana ; Brynda, Eduard ; Bačáková, Lucie
Currently used xenogeneic biological heart valve prostheses are decellularized and crosslinked with glutaraldehyde. These grafts usually undergo degeneration and calcification. Pericardium-based heart valve prostheses, re-seeded with autologous cells, i.e. Adipose tissue-derived cells (ASCs) and endothelial cells, could have longer durability and biocompatibility. In order to improve the adhesion of cells and their ingrowth into decellularized pericardium, various fibrin (Fb) layers were developed, i.e. Fb, Fb with covalently bound heparin (H), Fb with either vascular endothelial growth factor (VEGF) or fibroblast growth factor 2 (FGF) in various concentrations (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml) or with both VEGF and FGF (100 ng/ml). Growth factors were attached onto Fb via heparin or were adsorbed. ASCs were seeded on theses layers in a DMEM medium supplemented with 2 % of fetal bovine serum, TGFβ1 and BMP-4 (both 2.5 ng/ml), and with ascorbic acid. Cell adhesion and growth/viability was assessed by counted cell number/MTS evaluation. ASCs were stained for differentiation markers of smooth muscle cells, such as alpha-actin, calponin, and myosin heavy chain. On day 7, ASCs on Fb-H-VEGF layers produced both calponin and alpha-actin. An increased FGF concentration caused reduced calponin staining of ASCs. Lack of heparin in fibrin assemblies with growth factors inhibited the production of both alpha-actin and calponin in ASCs. The highest ASCs density/viability was found on Fb-H-VEGF-FGF layer. The proper formulation of fibrin coatings could be favorable for ASCs growth and differentiation and could subsequently support endothelialization of cardiovascular prostheses with endothelial cells.
|