|
|
The co-culture of keratinocytes and fibroblasts on a multi-layered polyester nanofibrous membrane enriched with platelet lysate
Blanquer, Andreu ; Filová, Elena ; Jenčová, V. ; Brož, Antonín ; Kuželová Košťáková, E. ; Lisnenko, M. ; Procházková, R. ; Bačáková, Lucie
The prevalence of chronic wounds is increasing due to the population ageing and specific illnesses like diabetes mellitus and vascular diseases. Nanofibrous membranes fabricated using synthetic polymers are promising materials to enhance skin wound healing. PCL and PVA membranes are being studied to be used as scaffolds for skin tissue engineering and hydrogels for controlled drug delivery, respectively. The present study considers the development of a multi-layered membrane made of PCL and PVA loaded with platelet lysate (PL). PCL nanofibers allowed cell adhesion and growth, whereas PVA acted as a hydrogel that releases the bioactive compounds of platelet lysate. The cytocompatibility of the membranes containing PL and without it was demonstrated on two cell types involved in wound healing, i.e. keratinocytes and fibroblasts. Both cell types were able to adhere and proliferate on the membranes. In addition, the membrane containing PL enhanced the proliferation of fibroblasts. A co-culture study was also performed by seeding each cell type on one side of the membrane. The cells were co-cultured for 7 days and the results showed that PL increased the proliferation of cells achieving a monolayer of keratinocytes or fibroblasts on each side of the membrane. Thus, the beneficial effect of PCL-PVA+PL membranes on monocultures and co-cultures of skin cells was demonstrated, and these membranes can be considered potential scaffolds for treatment of chronic wounds.
|
|
|
Differentiation of mesenchymal stem cells on fibrin assemblies supported by immobilized growth factors FGF2 and VEGF
Musílková, Jana ; Filová, Elena ; Kaplan, Ondřej ; Bačáková, Lucie
Bioartificial heart valves and vascular grafts prepared from decellularized tissues could be recellularized with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) that are able to differentiate into both smooth muscle cells and endothelial cells. MSCs differentiation is facilitated by sustained release of growth factors. In our study assemblies based on fibrin, fibrin with heparin, fibrin with adsorbed or covalently-immobilized vascular endothelial growth factor A165 (VEGF) or basic fibroblast growth factor (FGF-2) via binding to heparin attached to fibrin have been prepared and were evaluated for their stimulation of MSCs differentiation. We estimated the mRNA expression of endothelial marker CD31 (PECAM1), smooth muscle marker α-actin (ACTA2), osteoblast markers osteocalcin (BGLAP) and alkaline phosphatase (ALP). The gene expression was estimated using RT-PCR on days 1, 7 and 21 after seeding. The cell morphology and viability was evaluated by LIVE/DEAD staining. VEGF, both adsorbed and covalently bound, increased significantly the expression of smooth muscle marker α-actin. The mRNA expression of ACTA2 on day 7 and 21 raised more than 200 times in comparison to control samples (undifferentiated cells before seeding). The ACTA2 gene expression significantly exceeded the expression of all other evaluated genes at all time intervals. Moreover, on day 21, the late smooth muscle marker desmin (DES) was steeply rising in cells cultivated on assemblies containing heparin and covalently bound VEGF. The expression of osteocalcin was minimal. We conclude that fibrin assembly containing covalently bound VEGF is the most convenient for MSCs differentiation towards smooth muscle cells.
|
|
|
Differentiation of keratinocytes: molecular markers and potential of influencing them in vitro
Ondrúšková, Denisa ; Filová, Elena (vedoucí práce) ; Porubská, Bianka (oponent)
Keratinocyty sú najviac zastúpené kožné bunky nachádzajúce sa v pokožke - epidermis. Delia sa na bazálne proliferujúce kmeňové bunky, ktoré sú v úzkom kontakte s bazálnou membránou a na suprabazálne diferencujúce bunky. Bazálne keratinocyty exprimujú keratíny K5 a K14 a prostredníctvom delaminácie alebo asymetrickým delením dávajú vznik postupne diferencujúcim vrstvám. Ako prvá vzniká stratum spinosum exprimujúca keratíny K1 a K10 a involukrín, následne prechádza v stratum granulosum, v ktorej bunky exprimujú lorikrín a profilagrín a poslednú vrstvu tvorí stratum corneum, tvorená korneocytmi, ktoré sa postupne odlupujú. Keratinocyty sa podieľajú na procese regenerácie kože a je možné ich izolovať a kultivovať. Ich kultivácia môže byť ovplyvnená rôznymi faktormi, ako sú výber vhodného materiálu (nanovlákna/gél) a vhodného kultivačného média, ktoré môže byť obohatené o rastové faktory, doštičkový lyzát, vitamíny a ďalšie látky. Pri ich kultivácii taktiež záleží na tom, či sú keratinocyty úplne ponorené v médiu alebo rastú na rozhraní voda/vzduch. Pre priblíženie sa in vivo podmienkam a na štúdium interakcií medzi bunkovými populáciami sú keratinocyty častokrát pestované v ko-kultúrach s rôznymi bunkami, ako sú fibroblasty, endotelové bunky, monocyty a ďalšie. Keratinocyty kultivované in vitro sa...
|
|
|
Cévní a kostní buňky na polymerních strukturách pro tkáňové inženýrství
Filová, Elena ; Bačáková, Lucie (vedoucí práce) ; Maxová, Hana (oponent) ; Motlík, Jan (oponent) ; Kromka, Alexander (oponent)
Umělé cévní a kostní protézy jsou konstruovány jako inertní, neumožňující adhezi a růst buněk. Našim cílem bylo připravit materiály na bázi přírodních a syntetických polymerů, které by vytvářely nebo modifikovaly protézy, a testovat bioaktivitu těchto polymerů in vitro. Jako polymery přírodní jsme připravili fibrinové vrstvy o různé tloušťce a hodnotili jsme adhezi, růst a diferenciaci endotelových buněk (EC) na těchto površích. Pozorovali jsme zvýšené rozprostření endotelových buněk na dvourozměrných fibrinových vrstvách a zlepšený růst a maturaci těchto buněk na vrstvách trojrozměrných. Potažení fibrinu kolagenem I nebo fibronektinem dále zvětšilo adhezní plochu a proliferační aktivitu hladkých svalových buněk (VSMC). Syntetické polymery byly konstruovány na bázi blokového kopolymeru poly(DL-laktidu) a polyetylén oxidu (PDLLA-b-PEO), v kterých byl na 5% nebo 20% PEO řetězců navázán oligopeptid Gly-Arg-Gly- Asp-Ser-Gly, tj. ligand pro adhezní receptory buněk. Navázání oligopeptidu na antiadhezivní kopolymer obnovilo adhezi a růst VSMC, a to i v médiu bez séra. Syntetické polymery mohou tudíž sloužit jako umělá extracelulární matrix pro reparaci a regeneraci cév. V naší studii s lidskými kostními buňkami MG 63 kultivovanými na matrici z kopolymeru kyseliny polymléčné a polyglykolové jsme zjistili, že...
|
|
|
Růst lidských osteoblastů SaOS2 na titanu modifikovaném nanotubami.
Krýslová, Markéta ; Filová, Elena (vedoucí práce) ; Melkes, Barbora (oponent)
Tato práce shrnuje informace o interakcích mezi kostními osteoblasty a nanostrukturovanými materiály, které v dnešní době nabývají stále většího významu a nacházejí nové perspektivní uplatnění v medicíně a tkáňovém inženýrství. Každoročně se zvyšuje množství osob s umělou náhradou některých tkání, ale i celých orgánů, jako jsou kosti, klouby, zuby, chrupavky či šlachy. Mezi nejčastěji používané umělé materiály pro kostní náhrady patří titan a jeho slitiny. Titan má specifické vlastnosti, které umožňují implantátům setrvat v místě integrace déle než třicet let. Povrch titanu je pro lepší osteointegraci specificky upravován nejrůznějšími způsoby, např. potahováním hydroxyapatitem, potahováním vrstvou DLC (diamond like carbon) nebo plazmovým sprejováním. Nejnovější metodou povrchové úpravy titanu je takzvaná modifikace pomocí nanotub, které vytváří na povrchu implantátu nanodrsnost a zlepšují tak fyzikálně-chemické vlastnosti umělého materiálu. Nanostrukturovaný materiál napodobuje přirozenou strukturu kostní tkáně, podporuje adsorpci určitých proteinů, zlepšuje biokompatibilitu materiálu a příznivě ovlivňuje chování buněk, např. podporuje syntézu a vhodné uspořádání specifických molekul buněčné adheze a diferenciace.
|
|
|
Biomimetické modifikace titanu v tkáňovém inženýrství kostí.
Krýslová, Markéta ; Filová, Elena (vedoucí práce) ; Rampichová, Michala (oponent)
V okamžiku, kdy dojde k poškození či opotřebení kloubů, je jedním z řešení problému umělá náhrada. Nahrazením postiženého kloubu endoprotézou dochází ke snížení bolesti a pacient může opět vést kvalitní život bez omezení pohybu. Při konstrukci implantátu je třeba splnit všechna specifická kritéria na vlastnosti materiálu. Důležitý je hlavně jeho povrch, který je přímo spojen s kostní tkání. Po implantaci materiálu do kosti se může objevit řada negativních efektů např. infekce, zánět či uvolnění implantátu v důsledku nedostatečné osteointegrace. A právě vhodnou modifikací povrchu materiálu by mohla být zkvalitněna a urychlena osteointegrace a následná regenerace kostní tkáně. Tato práce se zabývá vývojem a hodnocením moderních materiálů imitujících strukturu kosti, zejména nanodrsnost a přítomnost biomimetické složky, např. hydroxyapatitu. V samotném experimentu je hodnocena adheze, proliferace, viabilita, diferenciace a syntéza specifických proteinů lidských osteoblastů linie Saos-2 na titanu modifikovaném nanotubami a hydroxyapatitem v porovnání s nemodifikovaným titanem. Klíčová slova: titan, osteoblasty, nanotuby, hydroxyapatit, nanodrsnost
|
|
|
Natural biomaterials and mesenchymal stem cells in regeneration of spinal cord injury
Kekulová, Kristýna ; Kubinová, Šárka (vedoucí práce) ; Krulová, Magdaléna (oponent) ; Filová, Elena (oponent)
Poranění míchy je závažné trauma a navzdory intenzivnímu výzkumu stále neexistuje účinná léčba pro pacienty. Cílem této dizertační práce je studium nových možností terapie míšního poranění na zvířecích modelech. Zaměřili jsme se na využití přírodních materiálů, kmenových buněk, genovou terapii a možnost kombinace těchto přístupů. Byl zkoumán efekt materiálů na bázi extracelulární matrix (ECM) připravených decelularizací prasečí míchy a prasečího močového měchýře na regeneraci tkáně po akutní hemisekci míchy. Dalším testovaným materiálem byl hydrogel na bázi kyseliny hyaluronové modifikovaný RGD adhesivním peptidem aplikovaný do léze po akutní a subakutní míšní hemisekci. Ukázali jsme, že oba typy biomateriálů pozitivně ovlivnily regeneraci míšní tkáně tím, že umožnily přemostění léze a podpořily vrůstání axonů. ECM hydrogely navíc podporovaly vrůstání cév do místa poškození. Kombinace hydrogelů s mesenchymálními kmenovými buňkami izolovanými z lidského pupečníku (hWJ-MSCs) měla synergický efekt, ale vzhledem k tomu, že do hydrogelů bylo možné inkorporovat pouze omezené množství buněk, nebyl tento efekt spojený se zlepšením motorických schopností. Limitací testovaných hydrogelů na bázi ECM je rychlá degradace materiálu, která neumožní plnohodnotnou obnovu poškozené tkáně. Další část práce je...
|
|
|
Studium vlivu mechanické zátěže na diferenciaci kmenových buněk na hladké svalové buňky.
Pražák, Šimon ; Filová, Elena (vedoucí práce) ; Maxová, Hana (oponent)
Kultivace buněk v bioreaktorech s mechanickou zátěží simuluje fyziologické podmínky, kterým jsou buňky v organismu vystaveny. Tato technologie byla využita pro navození diferenciace kmenových buněk z tukové tkáně směrem k fenotypu buněk vaskulární hladké svaloviny, které mohou dále sloužit pro tvorbu cévních náhrad. V současné době neexistuje zavedený postup kultivace kmenových buněk s mechanickou zátěží. Hlavním cílem této práce bylo proto optimalizovat strategii kultivace a stanovit ideální parametry zátěže. Diferenciace byla hodnocena pomocí imunofluorescence specifických markerů hladkosvalových buněk, a to α-aktinu a h1-calponinu, které byly kvantifikovány pomocí Western blotu. Pomocí imunofluorescenčního barvení byla také detekována produkce extracelulární matrix. Výstupem práce je ustanovení ideálních podmínek kultivace buněk v bioreaktoru s mechanickou zátěží, při kterých dochází k jejich diferenciaci do buněk hladké svaloviny. Pro kultivaci byly použity tři typy nosičů, a sice plazmované sklo, sklo s vrstvou fibrinu a decelularizovaný perikard. Předběžné výsledky ukazují, že diferenciaci směrem k hladkému svalu se podařilo navodit u lidských a prasečích kmenových buněk z tukové tkáně, kdy buňky byly analyzovány 3. a 7. den kultivace. Vypracování strategie kultivace kmenových buněk v...
|
|
|
Adhesion and growth of adipose tissue-derived stem cells on fibrin assemblies with attached growth factors for tissue engineering of heart valves
Filová, Elena ; Trávníčková, Martina ; Knitlová, Jarmila ; Matějka, Roman ; Kučerová, Johanka ; Riedelová, Zuzana ; Brynda, Eduard ; Bačáková, Lucie
Currently used xenogeneic biological heart valve prostheses are decellularized and crosslinked with glutaraldehyde. These grafts usually undergo degeneration and calcification. Pericardium-based heart valve prostheses, re-seeded with autologous cells, i.e. Adipose tissue-derived cells (ASCs) and endothelial cells, could have longer durability and biocompatibility. In order to improve the adhesion of cells and their ingrowth into decellularized pericardium, various fibrin (Fb) layers were developed, i.e. Fb, Fb with covalently bound heparin (H), Fb with either vascular endothelial growth factor (VEGF) or fibroblast growth factor 2 (FGF) in various concentrations (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml) or with both VEGF and FGF (100 ng/ml). Growth factors were attached onto Fb via heparin or were adsorbed. ASCs were seeded on theses layers in a DMEM medium supplemented with 2 % of fetal bovine serum, TGFβ1 and BMP-4 (both 2.5 ng/ml), and with ascorbic acid. Cell adhesion and growth/viability was assessed by counted cell number/MTS evaluation. ASCs were stained for differentiation markers of smooth muscle cells, such as alpha-actin, calponin, and myosin heavy chain. On day 7, ASCs on Fb-H-VEGF layers produced both calponin and alpha-actin. An increased FGF concentration caused reduced calponin staining of ASCs. Lack of heparin in fibrin assemblies with growth factors inhibited the production of both alpha-actin and calponin in ASCs. The highest ASCs density/viability was found on Fb-H-VEGF-FGF layer. The proper formulation of fibrin coatings could be favorable for ASCs growth and differentiation and could subsequently support endothelialization of cardiovascular prostheses with endothelial cells.
|
|
| |
host ::
RSS.