|
|
Heterologní exprese a purifikace potkaní formy cytochromu P450 1A1
Vlková, Michaela ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
Cytochrom P450 1A1 patří do "superrodiny" cytochromů P450 (CYP). Je to extrahepatální enzym, který se podílí na detoxikačním metabolismu mnoha xenobiotik, ale bohužel také zároveň patří mezi nejvýznamnější zástupce CYP účastnící se aktivace prokarcinogenů. Hlavním cílem této práce bylo pomocí heterologní exprese připravit a izolovat potkaní cytochrom P450 1A1 v dostatečném množství a čistotě. V rámci této práce byly připraveny dva vektory nesoucí gen pro potkaní cytochrom P450 1A1 vložené do účinného expresního plasmidu pCW. Funkčnost připravených vektorů byla ověřena expresí CYP1A1 a měřením CO diferenčních spekter. Zjistilo se, že pouze jeden z vektorů poskytoval nativní protein. Tento vektor byl transformován do buněk bakterií E.coli kmene DH5α, DH5α s vneseným plasmidem pHg1 a DH5α s vneseným plasmidem pGRO7. Byly testovány různé podmínky produkce CYP1A1: růstová média (LB a TB médium), čas produkce (24 a 48h), koncentrace IPTG (0,5mM a 1mM) a přítomnost ALA. Nejvyšší exprese bylo dosaženo v buňkách E.coli DH5α kultivovaných v modifikovaném TB médiu po 48 hodinách exprese a při teplotě 30řC (indukce při 0,6 - 0,8 OD600 0,5mM IPTG s přídavkem 0,5mM ALA). Úspěšně se podařilo exprimovat také CYP1A1 bez ALA za pomocí plasmidu pHg1, což velmi sníží ekonomické náklady celé produkce. Membrány buněk...
|
|
|
Heterologní exprese a izolace lidských isoforem cytochromů P450 1A1/2
Milichovský, Jan ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent)
Cytochromy P450 tvoří velmi početnou rodinu hemoproteinů. Řada z nich je zodpovědná za metabolismus endogenních látek, ale velmi významnou roli hrají i v detoxifikaci cizorodých látek (xenobiotik) a také v aktivaci některých z nich na reaktivní karcinogeny tvořící kovalentní adukty s DNA a zvyšující vnitrobuněčný oxidativní stres. Pro cytochromy P450 je typická nízká substrátová specifita, takže jeden enzym může oxidovat desítky až stovky různých substrátů. Mezi enzymy metabolizující planární aromatické sloučeniny (např. polycyklické aromatické uhlovodíky, azobarviva atd.) patří cytochrom P450 1A1, a dále cytochrom P450 1A2, který vykazuje podobnou substrátovou specifitu, ale preferuje mírně bazické aromáty, a mezi jinými metabolizuje například kofein. Tato práce se zabývá (i) přípravou expresních vektorů kódující geny lidských forem cytochromů P450 1A1 a 1A2, (ii) heterologní expresí těchto proteinů a (iii) izolací těchto lidských forem cytochromu P450. V rámci práce byly geny kódující oba proteiny proteiny upraveny a přeneseny ze starších vektorů do vysoce účinných expresních plasmidů pET- 22b. Jelikož však exprese v nových plasmidech neposkytovala nativní protein, byly připraveny expresní vektory s využitím původního expresního plasmidu pCW, které nesly upravený gen cytochromu P450 1A2. Kvůli...
|
|
|
Příprava rekombinantního cytochromu P450 1A1
Dvořák, Martin ; Svášková, Dagmar (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
4 Abstrakt Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1) je jednou z hlavních isoforem z celé "superrodiny" cytochromů P450 (CYP). Jedná se zejména o extrahepatální enzym, který se podílí na oxidaci mnoha polycyklických aromatických uhlovodíků a jiných xenobiotik. Vedle úlohy v detoxifikačním metabolismu je bohužel CYP1A1 také jeden z nejvýznamnějších CYP v aktivaci prokarcinogenů. Cílem této práce bylo připravit pomocí genové syntézy s optimalizací kodónů pro expresi v E. coli dvě různé varianty genu kódujícího potkaní CYP1A1, tj. "wild type" (wt1A1) a s pozměněnou N-terminální kotvou (mod1A1) (u obou pak modifikace s nebo bez His kotvy na C-konci), porovnat jejich expresi v různých typech buněk E. coli a případně se pokusit o purifikaci a srovnání enzymové aktivity genových produktů. Z navržených oligonukleotidů byly syntetizovány 2 "syntony" (části genu), vloženy samostatně do plasmidu pUC19, po ověření sekvence "vyštěpeny", spojeny a vloženy do expresního plasmidu pET-22b. Takto připravenými vektory byly transformovány 3 kmeny buněk E. coli, a to BL-21 (DE3) GOLD, RIL a RIPL. Byly testovány různé podmínky produkce požadovaných proteinů: teplota (18, 22, 24, 27 a 37 řC), čas produkce (až 48 hodin), koncentrace IPTG (0,1; 0,2; 0,5 a 1mM), OD600 při indukci (0,4; 0,6; 0,8; 0,9 a 1) a přidání ALA (0, 30, 60, 120 nebo 150...
|
|
|
Příprava vektorů pro heterologní expresi lidského cytochromu P450 1B1
Sojka, Pavel ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Laboratoř molekulární karcinogeneze a vývoje léčiv, pod jejíž záštitou byl tento projekt vypracován, se problematikou cytochromů P450 zabývá již delší dobu. Tyto enzymy se podílejí v drtivé většině na první fázi biotransformace jak xenobiotik, tak endogenních látek, méně často pak na syntéze např. látek steroidní povahy. Práce se zabývá přípravou expresních vektorů založených na plasmidu pET-22b, vhodných pro přípravu lidské formy cytochromu P450 1B1 metodou heterologní exprese. Tento cytochrom P450 je přítomný v endoplasmatickém retikulu především extrahepatálních tkáních a jeho exprese je navíc indukována dioxiny a polycyklickými aromatickými uhlovodíky. K přípravě vektoru byl použit gen pro lidský cytochrom P450 1B1, který byl pomocí metody PCR upraven. Na oba konce genu byla přidána štěpící místa pro restrikční endonukleasy a v jednom případě také úsek kódující histidinovou kotvu pro snadnější izolaci enzymu. Pomocí agarosové elektroforesy byl jak insert, tak štěpený plasmid verifikován a zároveň také purifikován k ligaci a následné transformaci konstruktu do kompetentních buněk E. coli DH5. Klíčová slova: cytochrom P450 1B1, karcinogeneze, plasmid, heterologní exprese
|
|
|
Heterologní exprese NADPH:cytochrom P450 reduktasy
Stráňava, Martin ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
NADPH:cytochrom P450 reduktasa (CPR) je flavoprotein o velikosti 78 kDa, který je spolu s cytochromy P450 součástí monooxygenasového systému vázaného v membráně endoplasmatického retikula. Monooxygenasový systém se účastní metabolizmu široké škály organických látek, včetně léčiv nebo různých polutantů přítomných v životním prostředí (polycyklické aromatické uhlovodíky, aromatické aminy aj.). CPR funguje jako přenašeč redukčních ekvivalentů z NADPH na příslušné cytochromy P450. Pro správnou interakci s cytochromy P450 je důležitá N-terminální hydrofobní doména kotvící protein v membráně. Odstranění této domény, např. trypsinovou proteolýzou, má za následek vznik solubilní CPR (72 kDa) a ztrátu katalytické aktivity vůči cytochromu P450. V průběhu heterologní exprese v bakteriích E. coli je proteolyticky labilní místo CPR (Lys56 - Ile57) cílem působení intracelulárních proteas s trypsinovou aktivitou, což může negativně ovlivnit výtěžky nativního 78 kDa proteinu. Předkládaná diplomová práce popisuje heterologní expresi, purifikaci a charakterizaci dvou forem potkaní CPR. Forma wtCPR představuje protein přirozeně se vyskytující v potkaním organismu (kmen Wistar), zatímco mCPR obsahuje aminokyselinovou substituci (K56Q) v místě proteolytické degradace. Výsledkem zmíněné substituce je proteolyticky...
|
|
|
Vliv optimalizace genu na rekombinantní expresi lidského cytochromu P450 3A4
Svobodová, Barbora ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Cytochrom P450 3A4 je integrální protein vyskytující se v membráně endoplasmatického retikula. U člověka se v nejvyšší míře vyskytuje v jaterní tkáni. Je důležitým enzymem metabolismu xenobiotik. V procesech biotransformace přeměňuje zhruba polovinu všech používaných léčiv. Hlavním cílem diplomové práce bylo ověřit vliv genové optimalizace na heterologní expresi lidského cytochromu P450 3A4. Při řešení práce byly nejprve připraveny a ověřeny expresní konstrukty založené na vektoru pET22b. Byla porovnána efektivita exprese zkrácené formy zájmového proteinu za použití syntetického genu optimalizovaného pro produkci v hostitelském organismu odvozeném od parentálního kmene K-12 vůči produkci stejně zkráceného cytochromu P450 3A4 v témže vektoru ovšem s originálním lidským genem získaným z cDNA. Bylo potvrzeno, že optimalizace nukleotidové sekvence genu pro hostitelský organismus E. coli skutečně činnost exprese zkrácené formy proteinu zvyšuje, i když množství aktivní formy proteinu nedosahuje výtěžků obvyklých u jiných netoxických solubilních proteinů. Kromě toho byl učiněn pokus o produkci kompletní nezkrácené formy lidského cytochromu P450 3A4 v expresním vektoru pET22b. Množství této formy proteinu přítomné v bakteriální membránové frakci však bylo ve srovnání se zkrácenou formou mnohem nižší....
|
|
|
Mechanismus působení protinádorového léčiva ellipticinu v cílových tkáních jeho účinku
Vranová, Iveta ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Martínková, Markéta (oponent)
Ellipticin je alkaloid čeledě Apocynaceae, který vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Na metabolismu ellipticinu se podílí cytochromy P450 (CYP) a peroxidasy za vzniku aktivačních a detoxifikačních metabolitů. Již v dřívějších pracích byly identifikovány jednotlivé isoformy CYP, které se podílí na oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce, ledviny) laboratorního potkana, vhodného modelu ilustrujícího osud ellipticinu v lidském organismu. V této diplomové práce byl studován vliv ellipticinu na obsah a aktivitu cytochromů P450 a na dalších složek MFO systému v tomto zvířecím modelu. Pro stanovení obsahu CYP a dalších složek MFO systému v isolovaných mikrosomech byly využity spektroskopické a elektrochemické metody. Pro stanovení katalytické aktivity CYP a NADPH:cytochrom P450 reduktasy byly využity reakce se specifickými substráty. Z výsledků vyplývá, že u zvířat premedikovaných ellipticinem dochází k zvýšení exprese i katalytické aktivity CYP podrodiny 1A ve všech testovaných orgánech (játra, ledviny, plíce). V játrech navíc dochází vlivem ellipticinu ke zvýšení exprese cytochromu b5 a zvýšení exprese a katalytické aktivity CYP3A. Podobně se i obsah a katalytická aktivita NADPH:cytochrom P450 reduktasy měnila v závislosti na premedikaci zvířat ellipticinem. Cytochrom P450 2S1...
|
|
|
Heterologní exprese lidské NADPH:cytochrom P450 reduktasy
Mazurová, Martina ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Ingr, Marek (oponent)
Se studiem karcinogenese přímo souvisí studium metabolismu xenobiotik, neboť ta se mohou na vzniku rakoviny podílet. Systém monooxygenas se smíšenou funkcí, který se na odbourávání cizorodých látek významně podílí, je v laboratoři, v níž byla práce prováděna, studován především pomocí experimentů in vitro. Pro získání potřebných rekombinantních enzymů se v současnosti hojně využívá metoda heterologní exprese. V této práci byla tato metoda použita pro přípravu lidské NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasy, membránového enzymu, který redukuje cytochrom P450 a tím umožňuje jeho katalytickou aktivitu. Byly připraveny a ověřeny vektory, nesoucí syntetický gen pro lidskou NADPH:cytochrom P450 oxidoreduktasu, založené na plasmidech pUC19 a pET22b. Reduktasa byla produkována v buňkách E. coli BL21-Gold a E. coli BL21-CodonPlus-RIL. Celková produkce proteinu v buňkách byla vysoká, problémem však bylo, že vznikající protein byl přítomen převážně v inkluzních tělískách. Byly částečně optimalizovány podmínky exprese tak, aby zvětšil podíl nativního proteinu v bakteriální membránové frakci.
|
|
|
Příprava rekombinantního lidského cytochromu b5
Hálková, Tereza ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
Cytochrom b5 je malý hemový protein. V lidském organismu se vyskytuje ve třech formách, a to vázaný v membráně endoplasmatického retikula (mikrosomální cyt b5) nebo ve vnější mitochondriální membráně, ale také jako solubilní forma v cytoplasmě maturovaných erytrocytů. Cytochrom b5 slouží zejména jako jednoelektronový přenašeč při různých reakcích, včetně reakcí katalyzovaných cytochromy P450. Jedním z cílů předkládané diplomové práce bylo připravit a izolovat solubilní králičí cytochrom b5, a to metodou heterologní exprese v Escherichia coli BL 21 Gold. Pro expresi byl použit expresní vektor založený na plasmidu pET22b, který nesl syntetický gen kódující králičí mikrosomální cytochrom b5, u něhož byla odstraněna část kódující C-terminální membránovou kotvu. Dále byly syntetizovány geny kódující lidský erytrocytární a mikrosomální cytochrom b5. Geny pro lidské cytochromy b5 byly vloženy do klonovacího vektoru pUC19, amplifikovány v kompetentních buňkách E. coli DH5α a verifikovány DNA sekvenací. Následně byly zkonstruovány a ověřeny expresní vektory pET22b obsahující geny kódující lidský mikrosomální a erytrocytární cytochrom b5. Klíčová slova: Heterologní exprese, genová syntéza, lidský cytochrom b5, izolace
|
|
|
Kvasinky jako model pro studium savčích onkogenních transkripčních faktorů
Novák, Josef ; Šťovíček, Vratislav (oponent) ; Zámostná, Blanka (vedoucí práce)
Kvasinky jsou výborným modelovým organismem pro studium buněčných pochodů a za tímto účelem pro ně bylo vytvořeno značné množství technik a protokolů. Pro studium transkripčních faktorů v kvasinkách jsou vytvořeny specifické postupy, jako jsou modifikované kvasinkové dvouhybridní systémy, jednohybridní systémy a systémy zkoumající schopnost transkripčního faktoru transaktivovat reportérový gen. V hlavní části této práce jsou podrobně popsány studie zkoumající savčí onkogenní proteiny komplexu AP-1 a proteinových rodin Myc a Myb. Pomocí kvasinkových modelů lze určovat strukturně- funkční vlastnosti zkoumaných proteinů a v některých případech i odhadnout jejich onkogenní vlastnosti (FASAY, schopnost proteinu c-Myc transaktivovat reportérový gen). Výsledky z kvasinkových modelů ovšem musí být ověřeny v savčích buňkách. 1
|
host ::
RSS.