|
|
Structural mass spectrometry of Bordetella virulence factors
Jurnečka, David ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent) ; Řehulka, Pavel (oponent)
Bakterie rodu Bordetella jsou aerobní gramnegativní kokobacily, které osidlují dýchací trakt u řady savců a tím způsobují různé druhy respiračních onemocnění. Bakterie produkují velké množství adhesivních molekul a toxinů, které se výrazně podílejí na rozvoji infekce a potlačení hostitelského imunitního systému. Mezi hlavní zástupce patří filamentózní hemaglutinin (FHA), který zajišťuje přilnutí bakterie k řasinkovému epitelu hostitele, a adenylát cyklázový toxin (CyaA), který je schopen potlačit baktericidní aktivitu fagocytů. CyaA, společně s α-hemolysinem (HlyA) z Escherichia coli a RtxA cytotoxinem z druhu Kingella kingae, patří do rozsáhlé skupiny takzvaných Repeats-in-toxin (RTX) cytolysinů/hemolyzinů, které jsou post-translačně modifikovány pomocí acylace konzervovaných lyzinových zbytků. Cílem této práce je strukturně-funkční charakterizace FHA molekul a analýza post-translačních modifikací u RTX toxinů a jejich hybridních variant pomocí hmotnostní spektrometrie. Za prvé, diferenciální izotopické značení 16O/18O odhalilo, že C- koncové aminokyseliny vysoce homologních FHA proteinů z Bordetella pertussis a Bordetella bronchiseptica jsou štěpeny na různých místech, a to v pozici 2348 pro B. pertussis a v pozici 2479 pro B. bronchiseptica. Za druhé, proteomická analýza tryptických fragmentů...
|
|
|
Molekulární mechanismy regulující virulenci lidského patogenu Bordetella pertussis
Hejnarová, Václava ; Večerek, Branislav (vedoucí práce) ; Jurnečka, David (oponent)
Bordetella pertussis je lidský patogen způsobující vážné respirační onemocnění černý kašel. Patogenita B. pertussis je zprostředkována celou řadou faktorů virulence. Mezi hlavní patří pertusový toxin, adenylát cyklázový toxin, pertaktin a filamentózní hemaglutinin. Úspěšnost infekce a kolonizace hostitele se odvíjí od správného načasování produkce faktorů virulence, k čemuž bakterie využívají řadu mechanizmů regulace genové exprese. Reakci na vnější podněty zajišťují dvoukomponentové fosfotransferázové systémy BvgAS, RisAK a PlrSR. Tyto systémy signální transdukce modulují odpověď bakterie na fyziologické prostředí hostitele a navozují jednotlivé fáze infekce. Další úroveň regulace poskytují nekódující RNA, konkrétně sRNA spolu s RNA chaperonem Hfq. Hfq je posttranskripční regulátor, který zprostředkovává interakce regulačních sRNA s cílovými mRNA, čímž ovlivňuje jejich translaci. U B. pertussis je tímto pleiotropním regulátorem ovlivněna exprese zhruba 10% všech genů, mezi které patří i faktory virulence, jako sekreční systém typu 3, adenylát cyklázový toxin, pertusový toxin a filamentózní hemaglutinin. Znalost těchto regulačních mechanizmů je klíčová pro porozumění jednotlivých fází tohoto onemocnění a může být nápomocná ke kontrole jeho šíření. Klíčová slova: Bordetella pertussis, faktory...
|
|
|
Mechanismus interakce bakteriálních toxinů zvyšujících vnitrobuněčné cAMP s hostitelskou buňkou
Lepesheva, Anna ; Mašín, Jiří (vedoucí práce) ; Petráčková, Denisa (oponent)
Cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) je univerzálním druhým poslem, který reguluje velké množství molekulárních mechanismů uvnitř buňky. Hladina syntetizovaného cAMP je přísně regulována vnitrobuněčnou adenylátcyklázou (AC), a proto tento enzym často představuje cíl pro různé bakteriální toxiny. Pro manipulaci s hladinou vnitrobuněčného cAMP v cílové buňce vyvinuly bakterie pro své toxiny dvě odlišné strategie. Adenylátcyklázový toxin (CyaA) bakterie Bordetella pertussis, edemogenní faktor (EF) bakterie Bacillus anthracis a ExotoxinY bakterie Pseudomonas aeruginosa mají ve své struktuře enzymatickou AC doménu, která má po aktivaci intracelulárním kofaktorem několikrát vyšší aktivitu než vlastní eukaryotní adenylátcykláza, nacházející se uvnitř hostitelské buňky. Jiné toxiny, jako pertusový toxin (PT) bakterie Bordetella pertussis, cholerový toxin (CT) bakterie Vibrio cholerae a tepelně labilní toxin bakterie Escherichia coli využívají ADP-ribosylaci heterotrimerních G proteinů spřažených s vnitrobuněčnou AC pro zvýšení její aktivity a následnou nekontrolovanou produkci cAMP. Tato práce představuje literární rešerši uvedených toxinů s důrazem na jejich molekulární mechanizmy interakce s hostitelskou buňkou. Klíčová slova: pathogenní bakterie, faktory virulence, vnitrobuněčná hladina cAMP, bakteriální...
|
|
|
Development of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Bordetella pertussis
Brázdilová, Ludmila ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Dráber, Peter (oponent)
Gram-negativní bakterie Bordetella pertussis je pathogen způsobující onemocnění zvané pertuse nebo černý kašel. Infekce je zvláště nebezpečná pro kojence a pokud není léčena, může být pro ně až smrtelná. Po zavedení acelulární pertusové vakcíny místo celobuněčné dochází k nárůstu případů onemocnění a pertuse je v rozvinutých zemích nejrozšířenější nemoc, jíž lze předejít očkováním. Z toho důvodu je důležitý vývoj nové generace vakcín a stoupá i důležitost metod vyhodnocujících účinnost vakcín. Měření opsonofagocytických procesů je jedna z metod využívaná k vyhodnocení odpovědi na vakcinaci. Hlavní cíl této práce je vývoj opsonofagocytických testů, které měří pohlcení částic a zabíjení mikroorganizmů pro měření funkčních vlastností protilátek proti Bordetella pertussis. Myší a lidské neutrofily byly izolovány třemi různými metodami, jejich opsonofgocytická aktivita byla porovnána a byly použity pro zhodnocení lidských a myších sér v opsonofagocytických testech. Různé experimentální podmínky opsonofagocytických testů byly testovány, včetně různých poměrů fagocytických buněk k bakteriálním buňkám a různých ředění sér. Opsonofagocytický test rozlišil naivní od imunizovaného séra. Sérum z myší vakcinovaných celobuněčnou vakcínou zvýšilo účinnost fagocytózy, kdežto to z myší vakcinovaných acelulární...
|
|
| |
|
|
Využití zvířecích modelů pro studium patogeneze Bordetella pertussis
Traganová, Veronika ; Holubová, Jana (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Bakterie B. pertussis je striktně lidským patogenem a původcem onemocnění známého jako černý kašel. Vzhledem k nárůstu případů infekcí touto bakterií v proočkované populaci se studium přenosu B. pertussis, působení jejích faktorů virulence a testování účinnosti nových i stávajících vakcín proti černému kašli, stává velmi aktuálním tématem. Podrobný výzkum interakce bakterie s hostitelem in vivo však vyžaduje vhodnou volbu zvířecího modelu. Nejběžněji používaným testovacím modelem pro studium B. pertussis je myš domácí laboratorní, která ale po infekci nevykazuje typické příznaky nemoci. V oblasti výzkumu a testování vakcín se osvědčil také model novorozených prasat. Zdaleka nejlepším zvířecím hostitelem B. pertussis je nedávno objevený model paviána anubi, který výborně imituje prostředí lidského dýchacího traktu, imunitní odpověď i přenos mezi hostiteli. Tato práce shrnuje základní poznatky o modelových organizmech používaných v minulosti i v současnosti pro studium B. pertussis. Zároveň se zabývá srovnáním výhod a nevýhod jednotlivých zvířecích modelů.
|
|
| |
|
|
Role segmentu 400-500 v biologické aktivitě adenylát cyklázového toxinu bakterie Bordetella pertussis
Suková, Anna ; Mašín, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Adenylát cyklázový toxin-hemolyzin (CyaA) je RTX protein, který hraje zásadní roli ve virulenci bakterie Bordetella pertussis, způsobující onemocnění černý kašel. CyaA dopravuje do cytosolu CD11b+ fagocytů svou enzymatickou adenylát cyklázovou doménu a katalyzuje přeměnu ATP na cAMP, které následně zablokuje baktericidní funkce fagocytů. Současně toxin vytváří v membráně cílových buněk póry, způsobující únik draselných iontů z buňky. Cílem této diplomové práce bylo analyzovat mechanizmus interakce domény spojující invazivní adenylát cyklázovou (AC) doménu a tzv. RTX hemolyzin s biologickou membránou. Z našich výsledků vyplývá, že tato doména interaguje s cílovou membránou a hraje zásadní roli v tvorbě malých pórů selektivních pro kationty. Získané výsledky budou zásadní pro pochopení interakce bakteriálních toxinů s cílovou membránou a naleznou reálné použití při vývoji terapeutických vakcín odvozených od CyaA. Klíčová slova: Bordetella pertussis, adenylát cyklázový toxin, translokace přes membránu, pórotvorná aktivita, černé lidipové membrány, liposomy
|
|
|
Pórotvorné vlastnosti toxinu CyaA bakterie Bordetella pertussis a složení membránové dvojvrstvy.
Rädisch, Robert ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Bordetella pertussis produkuje mnoho virulenčních faktorů mezi které patří adenylát- cyklázový toxin (ACT, CyaA). Tento toxin preferenčně napadá buňky imunitního systému, které mají integrinový receptor CD11b/CD18, a způsobuje tak oslabení imunitního systému hostitele. Na napadené buňky působí CyaA dvěma způsoby: 1) CyaA vytváří v membráně napadené buňky kationt-selektivní póry a způsobuje tak koloidně osmotickou lýzi napadené buňky, 2) CyaA způsobuje konverzi cytosolického ATP na signální molekulu cAMP, což způsobuje ztrátu fyziologických funkcí napadené buňky a taktéž vede k buněčné smrti. Cílem mé práce bylo otestovat vhodnost nového modelového systému ze syntetických lipidů - difytanoylů, pro charakterizaci pórotvorných vlastností adenylát-cyklázového toxinu. V minulosti se k charakterizaci využíval modelový systém z azolektinu, který je složen z mnoha různých lipidů a je tak příliš komplexní pro zjišťování úlohy jednotlivých lipidů. Dále byl zjišťován vliv cholesterolu na aktivitu adenylát-cyklázového toxinu v tomto systému, protože bylo zjištěno, že k translokaci adenylát-cyklázové domény dochází v lipidových raftech, které jsou bohaté na cholesterol. Posledním cílem mé diplomové práce bylo charakterizovat mnou nově objevený typ kanálu s dvěma vodivostními stavy. Klíčová slova: Bordetella...
|
|
|
Konstrukce geneticky detoxifikovaného kmene Bordetella pertussis pro výrobu nové generace celobuněčné vakcíny
Bočková, Barbora ; Holubová, Jana (vedoucí práce) ; Seydlová, Gabriela (oponent)
Bordetella pertussis je striktne lidský patogen kolonizující horní cestý dýchací. Zpusobuje respiratorní onemocnení zvane davivý kasel ci pertuse. Zavedení celobunecných vakcín, a nasledne vakcín acelularních, vedlo k výraznemu snízení výskýtu onemocnení a ke snízení prípadu umrtí spojených s infekcí. Epidemiologicka data vsak ukazují výrazný narust výskýtu onemocnení v posledních desetiletích. Duvod vzrustající incidence je pricítan predevsím prechodu z vakcín celobunecných na vakcíný acelularní. Na zaklade výzkumu z posledních let býlo prokazano, ze acelularní vakcíný mají radu nedostatku a je tedý nutne zmenit vakcinacní strategii. Jedním z mozných resení situace je vývoj nove generace celobunecných vakcín se snízenou reaktogenitou. Pro výrobu nove celobunecne vakcíný býl pripraven genetický modifikovaný kmen B. pertussis. Alelickou výmenou býla zajistena inaktivace enzýmaticke aktivitý pertusoveho toxinu, modifikace strukturý lipidu A a delece dermonekrotickeho toxinu. Tato kombinace genetických modifikací vedla u mýsí ke snízení reaktogenitý testovane vakcíný in vivo. Pri intranazalní infekci poskýtuje vakcína obsahující genetický modifikovaným kmenem stejnou ochranu jako vakcína obsahující kmen divoký. Býl take pozorovan vliv cýklodextrinu na toxicitu bakterialní suspenze. Odstranení...
|
host ::
RSS.