|
|
Exprese a purifikace N-koncové části filamentózního hemaglutininu z Bordetella Pertussis v E. Coli
Jurnečka, David ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
: Černý kašel je vysoce nakažlivé onemocnění způsobené gramnegativní bakterií Bordetella pertussis. V průběhu infekce bakterie produkuje celou řadu toxinů a adhezivních molekul, mezi něž patří i filamentózní hemaglutinin (FHA). FHA je 220 kDa povrchový protein, jenž je také produkován ve velkém množství do média, a hraje klíčovou úlohu v interakci mezi bakterií a hostitelskými buňkami. Cílem této práce bylo vytvořit heterologní expresní systém na produkci N-koncové části B. pertussis FHA (FHA1-862) v buňkách Escherichia coli. Pro sekreci proteinu FHA1-862 do media byl vytvořen plasmid skládající se ze systému dvou nezávislých T7/Lac promotorů, první pro gen fhaB kódující FHA1-862, a druhý pro gen fhaC kódující transportní protein, jenž umožňuje přenos FHA z periplasmatického prostoru do extracelulárního média. Protein byl úspěšně sekretován v buňkách E. coli BL21 nesoucí plasmid pMM100 (LacIq ) při 30 řC a přečištěn pomocí afinitní kapalinové chromatografie na nosiči Cellufine. Tyto výsledky naznačují, že protein FHA862 může být produkován expresním systémem E. coli, nicméně tento systém poskytuje malou výtěžnost proteinu.
|
|
|
Structural mass spectrometry of Bordetella virulence factors
Jurnečka, David
Bakterie rodu Bordetella jsou aerobní gramnegativní kokobacily, které osidlují dýchací trakt u řady savců a tím způsobují různé druhy respiračních onemocnění. Bakterie produkují velké množství adhesivních molekul a toxinů, které se výrazně podílejí na rozvoji infekce a potlačení hostitelského imunitního systému. Mezi hlavní zástupce patří filamentózní hemaglutinin (FHA), který zajišťuje přilnutí bakterie k řasinkovému epitelu hostitele, a adenylát cyklázový toxin (CyaA), který je schopen potlačit baktericidní aktivitu fagocytů. CyaA, společně s α-hemolysinem (HlyA) z Escherichia coli a RtxA cytotoxinem z druhu Kingella kingae, patří do rozsáhlé skupiny takzvaných Repeats-in-toxin (RTX) cytolysinů/hemolyzinů, které jsou post-translačně modifikovány pomocí acylace konzervovaných lyzinových zbytků. Cílem této práce je strukturně-funkční charakterizace FHA molekul a analýza post-translačních modifikací u RTX toxinů a jejich hybridních variant pomocí hmotnostní spektrometrie. Za prvé, diferenciální izotopické značení 16O/18O odhalilo, že C- koncové aminokyseliny vysoce homologních FHA proteinů z Bordetella pertussis a Bordetella bronchiseptica jsou štěpeny na různých místech, a to v pozici 2348 pro B. pertussis a v pozici 2479 pro B. bronchiseptica. Za druhé, proteomická analýza tryptických fragmentů...
|
|
|
Structural mass spectrometry of Bordetella virulence factors
Jurnečka, David
Bakterie rodu Bordetella jsou aerobní gramnegativní kokobacily, které osidlují dýchací trakt u řady savců a tím způsobují různé druhy respiračních onemocnění. Bakterie produkují velké množství adhesivních molekul a toxinů, které se výrazně podílejí na rozvoji infekce a potlačení hostitelského imunitního systému. Mezi hlavní zástupce patří filamentózní hemaglutinin (FHA), který zajišťuje přilnutí bakterie k řasinkovému epitelu hostitele, a adenylát cyklázový toxin (CyaA), který je schopen potlačit baktericidní aktivitu fagocytů. CyaA, společně s α-hemolysinem (HlyA) z Escherichia coli a RtxA cytotoxinem z druhu Kingella kingae, patří do rozsáhlé skupiny takzvaných Repeats-in-toxin (RTX) cytolysinů/hemolyzinů, které jsou post-translačně modifikovány pomocí acylace konzervovaných lyzinových zbytků. Cílem této práce je strukturně-funkční charakterizace FHA molekul a analýza post-translačních modifikací u RTX toxinů a jejich hybridních variant pomocí hmotnostní spektrometrie. Za prvé, diferenciální izotopické značení 16O/18O odhalilo, že C- koncové aminokyseliny vysoce homologních FHA proteinů z Bordetella pertussis a Bordetella bronchiseptica jsou štěpeny na různých místech, a to v pozici 2348 pro B. pertussis a v pozici 2479 pro B. bronchiseptica. Za druhé, proteomická analýza tryptických fragmentů...
|
|
|
Structural mass spectrometry of Bordetella virulence factors
Jurnečka, David ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent) ; Řehulka, Pavel (oponent)
Bakterie rodu Bordetella jsou aerobní gramnegativní kokobacily, které osidlují dýchací trakt u řady savců a tím způsobují různé druhy respiračních onemocnění. Bakterie produkují velké množství adhesivních molekul a toxinů, které se výrazně podílejí na rozvoji infekce a potlačení hostitelského imunitního systému. Mezi hlavní zástupce patří filamentózní hemaglutinin (FHA), který zajišťuje přilnutí bakterie k řasinkovému epitelu hostitele, a adenylát cyklázový toxin (CyaA), který je schopen potlačit baktericidní aktivitu fagocytů. CyaA, společně s α-hemolysinem (HlyA) z Escherichia coli a RtxA cytotoxinem z druhu Kingella kingae, patří do rozsáhlé skupiny takzvaných Repeats-in-toxin (RTX) cytolysinů/hemolyzinů, které jsou post-translačně modifikovány pomocí acylace konzervovaných lyzinových zbytků. Cílem této práce je strukturně-funkční charakterizace FHA molekul a analýza post-translačních modifikací u RTX toxinů a jejich hybridních variant pomocí hmotnostní spektrometrie. Za prvé, diferenciální izotopické značení 16O/18O odhalilo, že C- koncové aminokyseliny vysoce homologních FHA proteinů z Bordetella pertussis a Bordetella bronchiseptica jsou štěpeny na různých místech, a to v pozici 2348 pro B. pertussis a v pozici 2479 pro B. bronchiseptica. Za druhé, proteomická analýza tryptických fragmentů...
|
|
|
Molekulární mechanismy regulující virulenci lidského patogenu Bordetella pertussis
Hejnarová, Václava ; Večerek, Branislav (vedoucí práce) ; Jurnečka, David (oponent)
Bordetella pertussis je lidský patogen způsobující vážné respirační onemocnění černý kašel. Patogenita B. pertussis je zprostředkována celou řadou faktorů virulence. Mezi hlavní patří pertusový toxin, adenylát cyklázový toxin, pertaktin a filamentózní hemaglutinin. Úspěšnost infekce a kolonizace hostitele se odvíjí od správného načasování produkce faktorů virulence, k čemuž bakterie využívají řadu mechanizmů regulace genové exprese. Reakci na vnější podněty zajišťují dvoukomponentové fosfotransferázové systémy BvgAS, RisAK a PlrSR. Tyto systémy signální transdukce modulují odpověď bakterie na fyziologické prostředí hostitele a navozují jednotlivé fáze infekce. Další úroveň regulace poskytují nekódující RNA, konkrétně sRNA spolu s RNA chaperonem Hfq. Hfq je posttranskripční regulátor, který zprostředkovává interakce regulačních sRNA s cílovými mRNA, čímž ovlivňuje jejich translaci. U B. pertussis je tímto pleiotropním regulátorem ovlivněna exprese zhruba 10% všech genů, mezi které patří i faktory virulence, jako sekreční systém typu 3, adenylát cyklázový toxin, pertusový toxin a filamentózní hemaglutinin. Znalost těchto regulačních mechanizmů je klíčová pro porozumění jednotlivých fází tohoto onemocnění a může být nápomocná ke kontrole jeho šíření. Klíčová slova: Bordetella pertussis, faktory...
|
|
| |
|
|
Příprava Oryzasinu 1 pro štěpení proteinů v experimentech vodík/deuteriové výměny.
Šintáková, Kristýna ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Jurnečka, David (oponent)
Vodík/deuteriová výměna v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (HXMS) je stále populárnější technikou strukturní biologie. Její prostorové rozlišení závisí na účinnosti fragmentace nebo proteolytickém štěpení studovaného proteinu. Z toho důvodu je snaha hledat nové proteasy, které by nejen byly schopné štěpit zkoumaný protein při podmínkách HXMS, ale také poskytovaly co největší pokrytí sekvence proteinu. Tato práce se zabývá nalezením optimálních podmínek produkce aspartátové proteasy Oryzasinu 1 pro potenciální použití v experimentech HXMS. Z dostupných plazmidů byly vybrány vhodné produkční klony, pomocí peptidového mapování byla ověřena identita produkovaného proteinu a následně byly nalezeny vhodné produkční podmínky. Na základě těchto výsledků bylo přistoupeno k produkci proteinu ve velkém objemu a k izolaci inkluzních tělísek. Klíčová slova: Oryzasin 1, proteasy, vodík/deuteriová výměna v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (HXMS)
|
|
|
Strukturní analýza filamentózního hemaglutininu (FhaB) z Bordetella pertussis
Jurnečka, David ; Kavan, Daniel (vedoucí práce) ; Man, Petr (oponent)
: Filamentózní hemaglutinin (FHA) je adhesivní proteinová molekula, která je uvolňována gram-negativní bakterií Bordetella pertusis, způsobující infekční onemocnění zvané černý kašel (pertuse). C-koncový segment FHA hraje klíčovou roli v interakci mezi bakterií a hostitelskými buňkami, nicméně jeho struktura zůstává zatím neznámá. V této práci byla identifikována C-koncová aminokyselina FHA jako alanin v pozici 2304, zatímco C-koncová aminokyselina degradačního produktu FHA (FHA*) byla v pozici 2228. Spektroskopie cirkulárního dichroismu (CD) a nukleární magnetická resonance (NMR) ukázaly, že C-koncový fragment FHA (FHA 1995-2228) má alfa-šroubovicový charakter a netvoří definovanou terciární strukturu. Navíc, potlačení transkripce malé regulační RNA párující se k5' konci fhaB transkriptu vede k dvojnásobnému zvýšení produkce FHA. Ze získaných dat vyplývá, že C- koncový segment FHA má vlastnosti nestrukturovaných proteinů a produkce FHA je negativně regulována pomocí malé RNA. Klíčová slova: Bordetella pertussis, filamentózní hemaglutinin, malá RNA
|
|
|
Exprese a purifikace N-koncové části filamentózního hemaglutininu z Bordetella Pertussis v E. Coli
Jurnečka, David ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
: Černý kašel je vysoce nakažlivé onemocnění způsobené gramnegativní bakterií Bordetella pertussis. V průběhu infekce bakterie produkuje celou řadu toxinů a adhezivních molekul, mezi něž patří i filamentózní hemaglutinin (FHA). FHA je 220 kDa povrchový protein, jenž je také produkován ve velkém množství do média, a hraje klíčovou úlohu v interakci mezi bakterií a hostitelskými buňkami. Cílem této práce bylo vytvořit heterologní expresní systém na produkci N-koncové části B. pertussis FHA (FHA1-862) v buňkách Escherichia coli. Pro sekreci proteinu FHA1-862 do media byl vytvořen plasmid skládající se ze systému dvou nezávislých T7/Lac promotorů, první pro gen fhaB kódující FHA1-862, a druhý pro gen fhaC kódující transportní protein, jenž umožňuje přenos FHA z periplasmatického prostoru do extracelulárního média. Protein byl úspěšně sekretován v buňkách E. coli BL21 nesoucí plasmid pMM100 (LacIq ) při 30 řC a přečištěn pomocí afinitní kapalinové chromatografie na nosiči Cellufine. Tyto výsledky naznačují, že protein FHA862 může být produkován expresním systémem E. coli, nicméně tento systém poskytuje malou výtěžnost proteinu.
|
host ::
RSS.