|
|
Interaction of Galectin-1 with human NK cell receptors
de Sousa Santos Abreu, Celeste ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Přirozeně zabíječské buňky (z anglického natural killer cells) jsou subpopulace efektorových lymfocytů, které mají cytotoxickou aktivitu a schopnost produkovat cytokiny, považované za nedílnou součást vrozené imunitní odpovědi. Funkce NK buněk zahrnují eliminaci nádoru, zapojení a regulaci antivirových imunitních odpovědí a regulaci imunitních buněk produkcí a sekrecí chemokinů a cytokinů. CD69 je transmembránový receptor podobný lektinům typu C exprimovaný v NK buňkách. CD69 je aktivačním receptorem NK buněk a slouží jako velmi časný marker aktivace lymfocytů. V posledních letech byly popsány předpokládané proteinové ligandy CD69: Galektin-1, S1P1, S100A8/S100A9 a Myl9/12. Galektin-1 je typický lektin charakterizovaný přítomností společného lektinového strukturního motivu a domény rozpoznávající a podílející se na vazbě sacharidů. Galektin-1 byl identifikován jako vazebný partner pro CD69 na základě biologických a funkčních studií, ale strukturální podrobnosti o komplexu stále chybí. Tato práce popisuje úspěšné zavedení protokolu pro expresi mutované formy galektinu- 1 neobsahující cysteiny ani purifikační kotvu a studium interakce mezi galektinem-1 a receptory NK buněk. Interakce byla studovaná mikrotermoforézou a byla popsána jako závislá na přítomnosti N-vázané glykosylace na povrchu receptoru....
|
|
|
Studium interakce lektin-protilátka pomocí povrchové plasmonové rezonance
Zákopčaník, Marek ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
Cystická fibróza je autozomálně recesivní onemocnění, které postihuje zejména europoidní rasu. Je způsobeno mutacemi v CFTR genu, které vedou k poruchám funkce stejnojmenného iontového kanálu. Nejvíce je zasaženo dýchací ústrojí, jelikož změnou podmínek plíce ztrácí přirozenou obrannou funkci a stávají se tak náchylné k bakteriálním infekcím, které jsou nejčastější příčinou úmrtí pacientů s CF. Mezi tyto bakterie se řadí mimo jiné Burkholderia cepacia, která u pacientů s CF způsobuje velmi rychlou degradaci plicní tkáně. Boj s touto bakteriální infekcí komplikuje řada rezistencí vůči antibiotikům a tvorba biofilmu. Potenciálním prostředkem prevence bakteriálních infekcí plic pacientů s CF jsou slepičí protilátky proti bakteriálním lektinům. S využitím afinitní chromatografie na koloně s imobilizovaným lektinem BC2L-A byla získána frakce specifických protilátek. Imunoreaktivita směsné protilátky, afinitně purifikované protilátky a nezachycené frakce byla porovnána metodou ELISA. Z porovnání imunoreaktivity vychází, že došlo k zakoncentrování specifických protilátek více než 10×. Dále byla studována interakce lektin-protilátka pomocí metody SPR. V prvním uspořádání byla měřena síla vazby aktivního lektinu na glykosylace protilátek obsažených v nezachycené frakci. Disociační konstanta této interakce...
|
|
|
Development of new glycosylation methods for the synthesis of nucleosides
Downey, Alan Michael ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Křen, Vladimír (oponent) ; Kočovský, Pavel (oponent)
Nukleosidy jsou jako stěžejní složka DNA a RNA považovány za základ života. Na bázi nukleosidů je také založeno množství protinádorových a protivirových léčiv. Efektivnější metody pro získání těchto důležitých molekul by proto měly dopady, které přesahují rámec práce syntetického chemika a zasahují až do medicinální chemie a lékařského výzkumu. Jedním z nejnáročnějších kroků syntézy nukleosidů je glykosylační krok mezi heterocyklickým akceptorem (nukleobáze) a donorem na bázi sacharidu. Pro zabránění nežádoucích reakcí dalších reaktivních skupin a získání uspokojivých výtěžků s dobrými regio- a stereochemickými vlastnostmi je často nutné použít chránící skupiny. Tento proces protekce−glykosylace−deprotekce je pracný, neefektivní a často vyžaduje použití toxických činidel. Nová metoda, která by snižovala nebo odstraňovala potřebu použití protektivních skupin při glykosylaci, a přesto regio- a stereoselektivně poskytovala dostatečný výtěžek nukleosidů, by proto byla nanejvýš vítána. Tato disertační práce představuje moji snahu dosáhnout tohoto cíle. Bylo zjištěno, že za použití modifikovaných podmínek Mitsunobuovi rekce je možné bez potřeby chránění ostatních skupin přímo a stereoselektivně glykosylovat nukleobázi D-ribosou za vzniku β-ribopyranosyl nukleosidů. Použití 5-O-monochráněné ribosylové...
|
|
|
Charakterizace glykoforem haptoglobinu v lidském séru
Darebná, Petra ; Pompach, Petr (vedoucí práce) ; Ptáčková, Renata (oponent)
Charakterizace glykoforem haptoglobinu v lidském séru Petra Darebná (Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze, Česká republika) Změny v glykosylaci proteinů jsou spojovány s nádorovými onemocněními, především s hepatocelulárním a kolorektálním karcinomem. Tato práce se zabývá využitím na datech nezávislé analýzy pomocí iontově cyklotronové rezonance s Fourierovou transformací a tandemové hmotností spektrometrie s kapalinovou chromatografií a sledováním více reakcí ke kvantifikaci těchto změn u hepatocelulárního karcinomu, kolorektálního karcinomu a kolorektálního karcinomu s metastázemi do jater. V první fázi projektu byl haptoglobin směsných sér pacientů s hepatocelulárním karcinomem, kolorektálním karcinomem a kolorektálním karcinomem s metastázemi nabohacen pomocí hemoglobinu, imobilizovaného na aktivovanou CNBr Sepharosu 4B a následně purifikován pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie. Jednotlivé glykopeptidy haptoglobinu byly analyzovány pomocí iontově cyklotronové rezonance s Fourierovou transformací. V druhé fázi projektu byla použita pro analýzu změn glykosylace v závislosti na různém nádorovém onemocnění séra jednotlivých pacientů, u nichž byl částečně depletován albumin pomocí etanolového srážení. Jednotlivé fukosylované glykoformy N-glykopeptidů...
|
|
|
Role glykosylace ionotropních glutamátových receptorů v savčích neuronech
Danačíková, Šárka ; Horák, Martin (vedoucí práce) ; Kriška, Ján (oponent)
Glutamát je nejvíce zastoupeným excitačním neuropřenašečem v centrální nervové soustavě savců. Existují dva typy glutamátových receptorů, ionotropní a metabotropní, které se nacházejí v excitačních synapsích savců. Práce je zaměřena na ionotropní glutamátové receptory, které mají klíčovou roli v procesech učení a paměti. Hlavní subtypy ionotropních glutamátových receptorů byly označeny podle svých specifických agonistů: α-amino-3- hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionové kyseliny (AMPA), N-methyl-D-aspartátu (NMDA) a kainátu. Všechny typy ionotropních glutamátových receptorů, které se skládají do formy tetramerů, obsahují mnoho glykosylačních míst, které mohou být modifikovány glykany nebo monosacharidy. Glykany a monosacharidy navázané na receptory regulují klíčové procesy jako je skládání podjednotek, transport na buněčný povrch nebo funkce receptorů. Bylo zjištěno, že abnormální glykosylace ionotropních glutamátových receptorů může mít význam v rozvoji neurologických a psychiatrických poruch jako je například schizofrenie. Tudíž porozumění molekulárním mechanismům, které se podílejí na regulaci glykosylace ionotropních glutamátových receptorů, může mít význam pro vývoj nových způsobů léčby pacientů se změněnou funkcí glutamátergních synapsí v centrální nervové soustavě.
|
|
|
Study of NKp30 oligomerization and its interaction with B7-H6
Pažický, Samuel ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Man, Petr (oponent)
NK buňky jsou důležitou součástí imunitního systému. Jsou schopné rozeznat a zničit nádorové buňky a buňky infikované virem. Pro rozpoznání jejich cílových buněk hrají důležitou roli jejich aktivační receptory. Aktivační receptor NKp30, protein z rodiny přirozeně cytotoxických receptorů, váže několik ligandů přítomných na povrchu nádorových buněk anebo tvořících části některých virů. B7-H6 je jedním z ligandů NKp30 a díky jeho specifické konstitutivní expresi na povrchu některých nádorů a nádorových buněk je zajímavým biologickým cílem. Ačkoli již byla struktura komplexu NKp30/B7-H6 vyřešena, strukturní podstata některých důležitých vlastností vazby komplexu zatím nebyla vysvětlena. NKp30 tvoří oligomery, jejichž přítomnost je ovlivněna délkou C-konce NKp30 a jeho N-glykosylací, avšak strukturní podstata a ani význam těchto oligomerů nejsou známy. Navíc je vazebná afinita NKp30 k jeho ligandům ovlivněna přítomností jeho glykosylace a také jejím typem. V naší laboratoři jsme již dříve zjistili, že oligomerizace NKp30 je závislá na jeho glykosylaci. V mé práci jsem se pokusil získat detailnější funkční a strukturní informace o oligomerizaci NKp30 a vazbě B7-H6 multimetodickým přístupem včetně rentgenové krystalografie. Zodpovězení vznesených otázek by nejen přispělo k základnímu výzkumu aktivačních...
|
|
|
Příprava glykosylované formy lidského imunoreceptoru NKp30
Kalousková, Barbora ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
NK buňky (z angl. natural killer cells, přirozeně zabíječské buňky) hrají klíčovou roli v přirozené imunitě. Jejich úkolem je rozpoznávat a eliminovat infikované, stresované nebo maligně transformované buňky. K rozpoznání buněk slouží řada povrchových receptorů. Pro eliminaci buněk slouží cytotoxické mechanismy, které vedou k indukci apoptózy v cílové buňce. Jedním ze spouštěčů cytotoxické reakce je receptor NKp30, patřící společně s NKp46 a NKp44 do rodiny NCR (z angl. natural cytotoxicity receptors). Tato práce popisuje přípravu receptoru NKp30 s přirozenou i s jednoduchou glykosylací v expresním systému lidských embryonálních ledvinných buněk 293 (HEK293). Bylo zjištěno, že glykosylovaný receptor NKp30 tvoří nekovalentní oligomery. Mezi oligomery a monomery v roztoku se ustavuje rovnováha. Oligomerizace je závislá na glykosylaci, deglykosylovaný protein oligomery netvoří. Za účelem deglykosylace byla připravena rekombinantní endoglykosidasa ENDO F1.
|
|
|
Glykoproteiny ve slinách krevsajících členovců
Sumová, Petra ; Volf, Petr (vedoucí práce) ; Mikeš, Libor (oponent)
Krevsající členovci injikují během sání krve obsah svých slinných žláz do hostitele. Sliny krevsajících členovců obsahují celé spektrum bioaktivních makromolekul, jejichž hlavní funkcí je umožnění sání krve. Proti řadě těchto molekul je ovšem namířena protilátková odpověď hostitelského imunitního systému. Detekce této protilátkové odpovědi může, díky mezidruhovým odlišnostem v proteinovém složení slin, sloužit jako měřítko expozice hostitele jednotlivým druhům krevsajících členovců. Molekulami vyvolávajícími protilátkovou odpověď mohou být proteiny nebo glykoproteiny. Glykoproteiny jsou proteiny, na něž jsou glykosidicky vázány oligosacharidové řetězce. Za antigenní vlastnosti slinných glykoproteinů mohou být zodpovědné obě jejich složky, či pouze cukerná nebo proteinová část. Tuto skutečnost je třeba zohlednit při výběru expresního systému pro syntézu rekombinantních glykoproteinů. Tato práce shrnuje poznatky o struktuře, funkci a vlastnostech slinných glykoproteinů různých druhů krevsajících členovců.
|
|
|
Studium molekulárních mechanismů eliminace klinicky významných nádorů zabíječskými buňkami.
Libigerová, Martina ; Bosáková, Zuzana (oponent) ; Bezouška, Karel (vedoucí práce)
Sacharidy mají základní úlohu v široké škále biologických jevů. Je dobře známo, že většina eukaryotických bílkovin je glykosylovaných a že jejich glykosylace prochází dynamickými změnami, které stále ještě nejsou zcela objasněny. Nicméně, jedna z oblastí, ve které se význam povrchové glykosylace buněk stal v poslední době předmětem aktivního výzkumu, jsou nádorové plasmatické membrány, kde by mnoho změn v glykosylaci, mohlo být užitečných pro diagnózu a hlavně i pro léčbu zhoubných onemocnění. Zajímavé glykokonjugáty povrchu buněk, a to N-vázané a O-vázané oligosacharidy byly nalezeny terapeuticky atraktivní pro léčbu některých nádorů. A i když naše chápání účasti těchto hlavních tříd glykanů ve vzniku nádorů není ani zdaleka kompletní, existuje již několik příkladů protinádorové vakcíny na bázi sacharidů. Proto jsme se rozhodli tomuto tématu hlouběji věnovat, zejména molekulárním mechanismům zodpovědným za rozpoznání změn povrchové nádorové glykosylace buňkami imunitního systému. Přestože byly v minulosti v naší laboratoři identifikovány některé receptory lektinového typu specifické pro lektinové receptory přirozených zabíječských buněk, velmi málo je doposud známo o jejich tzv. endogenních ligandech na povrchu nádorových buněk, zejména na buněčném povrchu klinicky významných nádorů. Rozhodli jsme...
|
|
|
Charakterizace transgenních forem dipeptidylpeptidasy IV exprimovaných v astrocytární buněčné linii U373MG
Vomelová, Ivana ; Vaníčková, Zdislava (oponent) ; Bezouška, Karel (vedoucí práce)
Dipeptidylpeptidasa-IV (DPP-IV) je serinová proteasa, jejíž enzymová aktivita spočívá v odštěpování dipeptidů X-Pro z N-terminálního konce jejích substrátů. Řadu biologických funkcí je molekula DPP-IV schopna vykonávat neenzymově. Předchozí práce naší laboratoře prokázaly zvýšenou expresi DPP-IV ve vysokostupňových astrocytomech. Pro detailní studium enzymových a neenzymových funkcí DPP-IV v experimentálním modelu byly připraveny klony astrocytární buněčné linie U373MG transfekované enzymově neaktivní, mutovanou DPP-IV (mutDPP-IV) a enzymově aktivní DPP-IV přirozeného typu (wtDPP-IV). Enzymově neaktivní mutDPP-IV byla připravena bodovou mutací aminokyseliny serin, která je součástí aktivního centra. Buňky U373MG byly transfekovány doxycyklinem regulovatelným expresním systémem Tet-On® . K další analýze transgenních forem DPP-IV byly použity metodiky k ověření exprese na úrovni proteinu, enzymové aktivity a subcelulární lokalizace. U vyselektovaných doxycyklinem indukovaných buněk U373MG mutDPP-IV a U373MG wtDPP-IV, exprimujících mutovanou resp. přirozenou formu DPP-IV, narůstala exprese transgenních forem DPP-IV se zvyšující se koncentrací doxycyklinu a s prodlužujícím se časem indukce. U doxycyklinem indukovaných buněk U373MG exprimujících wtDPP-IV byl nárůst exprese provázán s nárůstem enzymové...
|
host ::
RSS.