|
|
Rekombinantní exprese receptoru myších NK buněk NKR-P1C
Rudenko, Anastassiya ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
NK buňky (z angl. Natural Killers) představují buňky stojící v první řadě obrany organismu proti různým nebezpečím, jakými jsou například viry nebo rakovinné buňky. NK buňky mají schopnost rozpoznat a zničit nežádoucí buňky několika různými způsoby, které se hodně liší od obranných mechanismů například u T- nebo B-lymfocytů. NK buňky nesou na svém povrchu širokou škálu různých aktivačních a inhibičních receptorů, pomocí kterých dokážou rozlišit zdravé buňky od škodlivých, či infikovaných buněk. NKR-P1 (z angl. natural killer receptor-protein 1) je první objevená rodina NK buněčných receptorů podobných lektinům C-typu, do které patří jak aktivační, tak inhibiční receptory. NKR-P1C je aktivační receptor, který je schopen tvorby homodimerů na povrchu NK buněk. Hlavními ligandy NKR-P1 rodiny receptorů jsou imunoenvasiny myšího cytomegaloviru a jiné molekuly strukturně odlišné od MHC glykoproteinů I. třídy. Tato práce se zabývá rekombinantní expresí receptorového proteinu NKR-P1C. Pomocí plazmidu pUT7 byla systémem PiggiyBac připravena stabilně transfekovaná linie buněk HEK293T nesoucí gen pro expresi extracelulární části NKR-P1C spojenou s Fc fragmentem IgG, které mezi sebou nesou zásahovou sekvenci pro štěpení TEV proteasou. Protein byl purifikován pomocí afinitní a gelové permeační chromatografie a...
|
|
|
Rekombinantní příprava isotopově značeného receptoru rNKR-P1A pro studium metodami NMR
Čonka, Martin ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent)
NK buňky patří mezi populaci lymfocytů, která je schopná cytotoxicky usmrtit některé nádorové a viry infikované buňky. Tato bakalářská práce se zaměřuje na potkaní receptor NK buněk, konkrétně rNKR-P1A. Tento protein patří mezi aktivační receptory a je schopen aktivovat cytotoxickou funkci NK buněk. Jeho fyziologický ligand a trojrozměrná struktura nebyly zatím rozřešeny. Cílem práce bylo optimalizovat produkci rNKR-P1A v minimálním médiu a následně produkovat isotopově značené proteiny. Isotopově značené proteiny by s využitím metod NMR mohly přispět k rozřešení trojrozměrné struktury tohoto potkaního receptoru.
|
|
|
NK cells and their receptors in immune regulation - possible targets for immunomodulation
Svoboda, Jan ; Fišerová, Anna (vedoucí práce) ; Pěknicová, Jana (oponent) ; Kročová, Zuzana (oponent)
(česky) Přirození zabíječi - buňky NK hrají důležitou roli v imunitním dohledu a regulaci jednak přímým cytotoxickým působením na infikované, transformované či jinak poškozené buňky, ale také produkcí cytokínů a chemokínů. Výsledná odpověď je dána převahou stimulačních nebo inhibičních signálů, přenášených širokou paletou membránových receptorů. Zabíječské s Ig- příbuzné molekuly KIR2DL4 a LILRB1, které rozpoznávají vlastní HLA-G molekuly během těhotenství stejně jako NKR-P1 receptory lišící se ve funkci a počtu izotypů jsou druhově závislé a redukované v průběhu fylogeneze, zatímco NKG2D, reagující na stresem indukované proteiny a adenozínové receptory (AR) potlačující zánětovou reakci, zůstávají evolučně konzervované. Cílem této práce bylo studium zapojení NK buněk a jejich receptorů v několika modelech imunitních poruch a u různých savčích druhů, za účelem získání nového náhledu na jejich funkci a možnost imunitní modulace. Ukázali jsme zde, že výběr druhu ve studiu ovlivnění NK buněčné funkce může být v některých případech kritický. Reakce na glykany, s využitím syntetického GlcNAc terminovaného glykomimetika GN8P, měla protichůdné účinky na NK buněčnou funkci u lidí a C57Bl/6 myší. U lidí byla snížena cytotoxická aktivita NK buněk s vysokou expresí NKR-P1A, zatímco u myší podání GN8P aktivalo...
|
|
|
Výzkum vzájemné interakce membránových receptorů NKR-P1D a Clrb
Hanč, Pavel ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Brdička, Tomáš (oponent)
Výzkum vzájemné interakce membránových receptorů NKR-P1D a Clrb Interakce myších receptorů NKR-P1D a Clrb byla poprvé popsána jako nový typ "MHC class-I independent missing-self recognition" poskytující ochranu před NK buněčným zabíjením.[1] Pozdější studie ale přinesla výsledky zpochybňující tato data a naznačující, že NKR-P1D váže Clrb pouze velmi slabě, jestli vůbec.[2] Abychom vnesli světlo na tyto diskrepantní výsledky, rekombinantě jsme připravili extracelulární domény obou receptorů v bakteriích E. coli a proteiny renaturovali in vitro. Kvalita renaturace byla ověřena určením zapojení disulfidických můstků a změřením 1 H/15 N-HSQC spekter. Pomocí gelové filtrace a analytické ultracentrifugy nebylo možno poskytnout přesvědčivé důkazy pro existenci interakce. Slabá, ale specifická interakce byla pozorována za použití SPR techniky. Tato interakce překvapivě vykazovala pH závislost. Interakce mezi proteiny v roztoku byla následně imobilizována pomocí techniky chemického zesítění proteinů. Byla použita činidla EDC, DSG a DSS. Reakční směsi byly rozděleny pomocí SDS-PAGE a dimery byly štěpeny proteasami v gelu. Pomocí FTMS bylo možné identifikovat peptidy z obou proteinů, které byly spojeny některým ze síťovacích činidel. Díky nedávno vyřešeným strukturám proteinů NKR-P1A a Clrg, které sdílí s NKR-P1D a...
|
|
|
Studium receptor-ligandového páru NKR-P1F a Clrg
Kotýnková, Kristýna ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Studim receptor - ligandového páru NKR-P1F a Clrg Myší receptor - ligandový pár NKR-P1F a Clrg je důležitou součástí receptorového "zipu", který vzniká při kontaktu mezi NK buňkou a cílovou buňkou. Tento pár představuje jeden z příkladů nedávno objevených interakcí typu lektin-lektin, které jsou důležité při rozpoznání u mnoha imunocytů. Za účelem studia struktury těchto proteinů a jejich vzájemné interakce byly připraveny vektory pET-30a(+) pro bakteriální expresi. Tyto vektory kódovaly části extracelulárních domén obou proteinů. Po indukci IPTG byly proteiny produkovány ve formě inkluzních tělísek, ze kterých byly renaturovány in vitro. Renaturované proteiny byly purifikovány kombinací ionexové a gelové chromatografie. Konstrukt pro protein NKR-P1F poskytoval při použití standardních renaturačních protokolů pouze malé výtěžky solubilního proteinu, a navíc vyvstaly problémy s reprodukovatelností výsledků renaturace. V případě Clrg nebyly standardní postupy skládání úspěšné. Kvůli tomu bylo přistoupeno k mutaci lichého cysteinu, který nezapadal do obvyklého vzoru pro tyto receptory. Cystein byl mutován na serin a produkt výsledného C148S konstruktu již bylo možnorenaturovat in vitro. Dále bylo zjištěno, že přídavek (benzyldimethylamonnia)propansulfonátu do renaturačního pufru zvyšuje výtěžek solubilního...
|
|
| |
|
|
Carbohydrate dimers in tumor immunotherapy
Krupová, Monika ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Využití sacharidových dimerů v imunoterapii nádorů Monika Krupová (Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze) Jednou ze strategií pro imunoterapii nádorů je aktivace cytotoxických lymfocytů pomocí ligandů specifických pro jejich povrchové receptory. CD69 je široce rozšířeným receptorem na povrchu mnoha buněk hematopoietického původu, a protože jeho fyziologický ligand nebyl zatím popsán, na modulaci jeho funkcí se dají použít různá ligandová mimetika. Mimetika testované v předkládané práci jsou založené na mono- či disacharidech spojených pomocí dvou různých funkčních skupin, které tvoří thiomočovinovou a triazolovou sérii. Při precipitačních studiích byla sledována schopnost precipitovat rozpustný NKR-P1 a CD69 receptor, přičemž se zjistilo, že optimalizovaná délka spojky pro navázání látky na NKR-P1 receptor je decyl. Naproti tomu aktivace receptoru CD69 neni až tak závislá na délce spojky. Cílem této práce bylo z imunologického hlediska prozkoumat vlivy jednotlivých testovaných látek na bunečnou signalizaci, cytotoxicitu vůči buňkám nádorové linie a aktivaci vyvolanou apoptózu. Největší vliv na signalizaci, sledovanou pomocí produkce inositolfosfátů a vápenatých iontů a stejně tak na přirozené zabíjení, měly látky triazolové série obsahující ve své molekule dva...
|
|
|
Příprava rekombinatních extracelulárních domén leukocytárních receptorů AICL a NKR-P1CBALB
Čonka, Martin ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Cebecauer, Marek (oponent)
v českém jazyce NK buňky jsou řazeny mezi populaci lymfocytů, která je schopna cytotoxicky usmrtit některé nádorové či viry infikované buňky. Předmětem této diplomové práce je myší NK buněčný receptor mNKR-P1CBALB a lidský leukocytární receptor hAICL. mNKR-P1CBALB je řazen mezi aktivační receptory a je schopen aktivovat cytotoxické funkce NK buněk vůči cílovým buňkám. Receptor hAICL je ligandem lidského aktivačního NK buněčného receptoru NKp80. Interakce mezi těmito proteiny též vede k aktivaci efektorových funkcí NK buněk. Cílem této práce bylo připravit rekombinantní extracelulární části receptorů mNKR-P1CBALB a hAICL, optimalizovat jejich in vitro renaturaci a charakterizovat tyto proteiny pomocí hmotnostní spektrometrie. Takto získané proteinové preparáty poslouží k dalšímu studiu struktury extracelulárních částí těchto leukocytárních receptorů.
|
|
|
Příprava nádorového ligandu B7-H6 s coiled-coil kotvou a ověření jeho vazby na receptor NKp30
Krejčová, Kateřina ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
NK buňky jsou přirozené zabíječské buňky (z angl. natural killer cells) podílející se na protinádorové imunitě. Tyto buňky jsou schopny zabránit vzniku virové infekce či nádorového onemocnění, a to bez předešlé senzitizace antigenem. Mechanismus aktivace NK buněk je založen na principu snížené exprese MHC gp I molekul na povrchu nádorových buněk. Na povrchu NK buněk jsou přítomny receptory, které jsou schopny rozlišit jak aktivační, tak inhibiční signály, které rozhodují o tom, zda dojde k aktivaci NK buněk a zabití cílové buňky, či nikoliv. NKp30 je transmembránový receptor I. typu, který rozeznává stresem indukovaný buněčný ligand B7-H6. Interakce těchto proteinů je signálem pro imunitní systém k zahájení imunitní odpovědi. Tato práce se zaměřuje na přípravu buněčného ligandu B7-H6 s peptidovou coiled- coil kotvou v liniích lidských embryonálních ledvinných buněk HEK293S GnTI- a HEK293T. Byl úspěšně připraven protein s coiled-coil kotvou na C-konci proteinu, což bylo ověřeno hmotnostní spektrometrií. Rovněž byla pomocí sedimentační analýzy potvrzena interakce připraveného proteinu s receptorem NKp30. Klíčová slova: NK buňky, rekombinantní exprese, B7-H6, HEK293, coiled-coil
|
|
| |
host ::
RSS.