|
|
Izolace bakteriálního flagelinu jako imunogenu pro přípravu protilátek pro pacienty s cystickou fibrosou
Antipova, Valeriia ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Vyhnalová, Kateřina (oponent)
Cystická fibroza (CF) je autosomálně recesivní onemocnění, postihující hlavně plíce, ale také i další orgány včetně jater, slinivky břišní a reprodukčních orgánů. V postižených orgánech dochází k nahromadění hustého lepkavého hlenu zvaného těž mukus. CF je způsobena mutacemi v CFTR genu, který se nanchází na dlouhém raménku 7. chromozomy. Tyto mutace vedou pak k mutacím v kódovaném CFTR proteinu. Mutace CFTR proteinů způsobují poruchy transportu chloridových iontů. Jedním z nejčastějších projevů CF jsou časté plicní infekce vyvolané bakteriemi, které se velmi dobře množí v plicním mukusu. Jednou z takových bakterií je Burkholderia cepacia (BC). BC je aerobní, gramnegativní, podmíněně patogenní mikroorganismus, který představuje nebezbečí pro lidi se sníženou imunitou. BC a některé další mikroorganismy se nazývají "bakteriemi nemocnice", což je problém pro pacienty s CF, kteří jsou často hospitalizováni. BC nejčastěji obsahují jeden polární bičík, který slouží k pohybu a adherenci k povrchu buněk hostitele. Bičík, který je především složen z proteinu flagelinu, představuje jeden z hlavních virulentních faktorů bakterie BC. Táto práce je zaměřena na hledání optimálního způsobu izolace bakteriálního flagelinu z bakterie Burkholderia cepacia. Flagelin pak může sloužit jako imunogenem pro přípravu...
|
|
|
Studium potenciálních anti-adherenčních sloučenin na buněčném modelu plic jako prostředku profylaxe bakteriálních infekcí u cystické fibrózy
Áčová, Andrea ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Nosková, Libuše (oponent)
4 Abstrakt Cystická fibróza (CF) je zákeřné genetické onemocnění s autosomálně-recesivní dědičností. Narušená funkce CFTR proteinu zapříčiněná mutací ve stejnojmenném genu způsobuje celou řadu symptomů, z níž nejzávažnější je ovlivnění respirační soustavy. Hlavním důvodem je výskyt hustého hlenu, který se podílí na kumulaci bakteriálních buněk v plicích pacienta. Mezi životohrožujíci patogeny patří bakterie Burkholderia cenocepacia (BC) a Pseudomonas aeruginosa (PA). Tyto bakterie produkují množství virulentních faktorů, jako jsou např. lektiny BC2L-A či BC2L-C u BC a PA-IIL u PA. Díky nim se bakterie prostřednictvím protein-sacharidových interakcí váží na plicní buňky s pozměněnou glykosylací, která se vyskytuje u nemocného jedince s CF. V této práci byla předmětem studia právě tato lektinová interakce a inhibiční vliv slepičích protilátek IgY nebo trivalentních fukosylovaných glykoklastrů na adherenci BC (kmen ST-32, CCM 7291) / PA (kmen PAK, ST 1763) na buňky epitelu plic linie CuFi-1 (od nemocného jedince s CF) / NuLi-1 (od zdravého dárce). Bylo proto studováno možné ovlivnění viability buněk PA (kmene PA-lux) glykoklastry, které neukázalo žádný signifikantní efekt. Pro ověření exprese lektinu BC2L-C bylo nutné připravit protilátky. Slepičí protilátky proti N-terminální doméně lektinu BC2L-C na "Western...
|
|
|
Studium profylaktického účinku glykoklastrů na modelu bakteriální adherence
Kurucová, Michaela ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Cystická fibróza (CF) jako autozomálně recesivní genetické onemocnění vzniká mutaci CFTR genu kódujícího CFTR protein, který v organismu plní především funkci chloridového kanálu. Porucha transportu chloridových iontů vede u nemocných k mnoha orgánovým dysfunkcím, s největšími dopady na respirační soustavu. Charakteristickým znakem CF je zvýšená adheze bakterií (zejména Pseudomonas aeruginosa, PA) k epitelu plic, která vzniká v důsledku tvorby velmi hustého hlenu a modifikaci glykosylace v plicích. K patogenitě PA významně přispívají její virulentní faktory, konkrétně lektiny PA-IL a PA-IIL, které prostřednictvím vazby na povrchové receptory obsahující D-galaktosu (PA-IL) nebo L-fukosu (PA-IIL) umožňují adhezi PA k hostitelským buňkám. Hlavním cílem této práce bylo prokázat schopnost synteticky připravených multivalentních inhibitorů na bázi fukosy a galaktosy inhibovat adhezi PA na epiteliální buňky plic. Testované trivalentní glykoklastry působící právě proti výše zmíněným lektinům PA byly studovány ex vivo pomocí tzv. adhezního testu využívajícího imortalizované epiteliální buňky linie CuFi-1 (z plic pacienta s CF) a linie NuLi-1 (od zdravého jedince). K monitorování bakteriální adheze byl využit kontrolní kmen PA, označovaný jako PAK (ST 1763). Pro účel vizualizace a stanovení množství bylo...
|
|
|
Congenital disorders of glycosylation and their impact on cellular and energetic metabolism
Rychtárová, Lucie ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent) ; Pecinová, Alena (oponent)
Dědičné poruchy glykosylace (CDG) jsou velkou skupinou více než 160 typů metabolických poruch způsobených genetickými defekty, které vedou k poruše biosyntézy a modifikace glykanů. Nezastupitelnou roli v biosyntéze glykanů hraje lipid dolichol. Glykany hrají klíčovou roli ve funkci a struktuře proteinů a lipidů a jejich nedostatek vede k závažným klinickým příznakům. CDG se obvykle projevuje v dětství jako multisystémová porucha. Rodiny tak čelí závažnému zdravotnímu problému vzhledem k progresivní a velmi variabilní povaze onemocnění, nepříznivé prognóze a až na výjimky nedostupnosti léčby. V současné době stále nemáme k dispozici dostatečnou paletu metod k rozpoznání vzácných typů CDG a naše znalosti patofyziologie CDG jsou zatím omezené. Prvním cílem práce bylo optimalizovat metodu stanovení izoforem dolicholu a studovat je ve fyziologii a patologii. Druhým cílem práce bylo prozkoumat bioenergetický stav a celkový metabolismus u nejčastějšího typu CDG - poruchy fosfomanomutázy 2 (PMM2-CDG), au CDG způsobených defektem biosyntézy dolicholu. Pomocí optimalizované metody byla v populaci charakterizována distribuce izoforem dolicholu v moči. Profil izoforem dolicholu se mění s věkem, což naznačuje možné změny fyzikálních vlastností membrán během stárnutí v důsledku proporcionální změny izoforem...
|
|
|
Příprava a charakterizace slepičích protilátek proti patogenní kvasince Candida albicans
Vodecký, Matúš ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Nárůst počtu infekcí způsobených kvasinkovými patogeny je alarmujícím problémem celosvětového veřejného zdraví. Nejvíce jsou ohroženi lidé s narušeným imunitním systémem, jako např. po infekci virem lidské imunodeficience nebo při diabetes mellitus. Diagnostika je častokrát nedostatečná a léčba je odkázána na omezený výběr antimykotik, na která navíc narůstá rezistence. Tyto aspekty představují velký problém, jelikož je pak na rezistentní patogeny třeba podávat léky druhé volby, které mohou mít vedlejší toxické účinky (např. nefrotoxicita v případě amfotericinu B). Vzhledem k závažnosti kvasinkových infekcí je snaha najít způsob ochrany vůči těmto patogenům. Jednou z možností je pasivní imunoterapie. V této bakalářské práci byly pro tento účel zvoleny protilátky ze slepičích vajec, které mají potenciál širokého terapeutického použití. Příprava slepičích protilátek IgY ze žloutků vajec je jak z etického, tak ekonomického pohledu výhodná. Žloutkové protilátky navíc vykazují poměrně vysokou stabilitu. Z vajec slepic imunizovaných buď buněčnou stěnou nebo celými buňkami C. albicans po kultivaci v médiu simulujícím vaginální prostředí (VSF) byly izolovány polyklonální protilátky. Reaktivita protilátek byla testována metodou ELISA. Jako antigen byly použity buněčné stěny C. albicans kultivovaných v médiu...
|
|
|
Interakce bakteriálních lektinů s epitelem lidských plic
Vyhnalová, Kateřina ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Cystická fibróza (CF) je autozomálně recesivní onemocnění způsobené mutacemi v genu CFTR (z angl. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) kódujícího stejnojmenný chloridový kanál, který je přítomen na apikální membráně epiteliálních buněk. Důsledkem těchto mutací je narušen transepiteliální transport iontů a regulace dalších iontových kanálů. Cystická fibróza primárně postihuje respirační systém, kde v důsledku dysfunkce CFTR proteinu dochází k akumulaci nadměrně viskózního hlenu a ke změnám glykosylace sacharidových struktur na povrchu plicního epitelu. Tento patologický stav predisponuje pacienty s CF k bakteriálním infekcím plic, které jsou hlavní příčinou úmrtí pacientů s CF. Nejčastějším patogenem kolonizujícím respirační systém pacientů s CF je Pseudomonas aeruginosa (PA). Pro adhezi na hostitelskou tkáň PA využívá řadu faktorů virulence, včetně lektinu PA-IIL, který se vyznačuje nezvykle vysokou afinitou k L-fukose. V této práci byl studován vliv vybraných monosacharidů a multivalentních inhibitorů na bázi fukosy (glykoklastrů) na vazbu PA-IIL na epitel lidských plic. Pro zkoumání účinku daných agens ex vivo byly použity do parafinu zalité tkáně lidských plic fixované formalinem (FFPE tkáň; z angl. formalin-fixed paraffin-embedded tissue) zdravého jedince a pacienta s CF. Lektin...
|
|
|
Nové analogy růstového faktoru podobného insulinu (IGF-1) pro studium receptorů a terapeutické aplikace
Lin, Jingjing ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent) ; Lapčík, Oldřich (oponent)
Systém insulin/IGF je evolučně konzervovaný systém, který zahrnuje tři blízce příbuzné peptidové hormony (insulin, IGF-1 a IGF-2), tři homologní tyrozin-kinázové receptory (IR-A, IR- B a IGF-1R), odlišný receptor IGF-2R a šest proteinů vážících IGF. Zatímco insulin signalizuje hlavně prostřednictvím IR a hraje klíčovou roli v homeostázi glukózy, IGF signalizují hlavně prostřednictvím IGF-1R a zprostředkovávají normální lidský růst. Pro správné fungování organismu je klíčová přísná kontrola exprese ligandů i receptorů. Aberantní signalizace prostřednictvím těchto receptorů se projevuje u mnoha patologických stavů, včetně rakoviny, poruch růstu, neurodegenerativních onemocnění a diabetu. Osa insulin/IGF proto představuje slibný terapeutický cíl. Vzhledem k četným neúspěšným klinickým protinádorovým studiím prováděným buď s inhibitory tyrosin-kináz, nebo s protilátkami namířenými proti IGF-1R, by byl zajímavý vývoj nových receptorově specifických analogů insulinu a IGF s minimalizovanými vedlejšími účinky. Naše studie začala rekombinantní přípravou dimerů IGF-1, v nichž jsou monomery IGF-1 propojeny mezi svými C- a N-konci Ser-Gly linkery (délka 8, 15 nebo 25 zbytků). Cílem bylo zjistit, zda vazba dvou kovalentně spojených molekul IGF-1 na receptor může tento receptor inhibovat nebo aktivovat. Dále...
|
|
|
Terpene discovery combining in silico and molecular biology approaches
Smrčková, Helena ; Pluskal, Tomáš (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent)
Terpenoidy představují rozsáhlou a chemicky i strukturně rozmanitou skupinu metabolitů, což z nich činí významný zdroj potenciálních terapeutik. Terpenoidy jsou běžně využívány v potravinářství, farmacii, kosmetice či jako paliva. Výchozí látky pro biosyntézu terpenů jsou kondenzované a v některých případech cyklické uhlovodíky syntetizované z lineárních isoprenyl pyrofosfátů enzymy terpensynthasami. Tato rozsáhlá proteinová rodina sdílí společné motivy a domény určující funkci, které lze použít jako matrici pro hledání homologů mezi proteiny s dosud neznámou funkcí. Potenciál necharakterizovaných proteinů produkovat dosud nepopsané terpenové struktury byl hodnocen in silico pomocí metody vyvinuté v laboratoři Mgr.Tomáše Pluskala, Ph.D. na Ústavu organické chemie a biochemie Akademie věd ČR. Devět proteinů pocházejících z rostlin, bakterií a hub bylo podrobeno heterologní expresi v upravených kvasinkových kmenech JWY501 a ZX178-08, které nadměrně produkují nezbytné isoprenyl pyrofosfátové prekurzory. Výsledné extrakty kvasinkových kultur byly analyzovány pomocí plynové chromatografie-hmotnostní spektrometrie a kapalinové chromatografie- hmotnostní spektrometrie, přičemž pět z devíti proteinů vykazovalo terpensynthasovou aktivitu. Bylo zjištěno, že dva seskviterpeny produkované houbovým enzymem...
|
|
|
Vliv vybraných parfémů na aktivitu aromatasy
Drejslarová, Iva ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Smrček, Stanislav (oponent)
Cytochromy P450 jsou enzymy zapojené do mnoha fyziologických procesů v organismu, kromě metabolismu xenobiotik také do biosyntézy a katabolismu endogenních látek, jako jsou hormony a steroidy. Cytochromy P450 zodpovědné za přeměny endogenních sloučenin mohou být ovlivněny xenobiotiky, které různými mechanismy zasahují do sekrece, metabolismu, transportu či eliminace endogenních hormonů. Tyto látky se také označují jako endokrinní disruptory a řadí se mezi ně například pesticidy, insekticidy, některá léčiva, nebo sloučeniny obsažené kosmetických prostředcích. Jedním z mechanismů jejich působení je zásah do biosyntézy steroidních hormonů prostřednictvím interakcí se steroidogenními enzymy. Takovým enzymem je cytochrom P450 19, aromatasa, který v posledním kroku biosyntézy steroidních hormonů katalyzuje konverzi testosteronu na ß-estradiol. Následkem narušení aktivity tohoto enzymu endokrinními disruptory je nerovnováha hladiny estrogenů v organismu, která může vést k poškození reprodukčních funkcí, vzniku osteoporózy, aterosklerózy, demence, či rozvoji některých typů karcinomů. V této souvislosti byl zkoumán vliv komerčně dostupných parfémů na konverzi testosteronu na ß-estradiol, jenž je katalyzována aromatasou. Ovlivnění aktivity tohoto enzymu bylo stanoveno pomocí HPLC a HPLC ve spojení s...
|
|
|
Vliv přírodních látek na transkripční aktivitu jaderných a steroidních receptorů a expresi cytochromu P450 (CYP1A)
Bednaříková, Barbora ; Hodek, Petr (oponent)
Tato práce vychází ze dvou přiložených prvoautorských publikací, které se zabývají vlivem přírodních látek rostlinného původu na transkripční aktivitu jaderných a steroidních receptorů a jejich vlivu na expresi cytochromu P450, podrodiny CYP1A. Studovanými látkami jsou anthokyanidiny a stilbeny, patřící do široké kategorie fenolických látek. Cílem první studie bylo vyhodnotit vliv nejběžnějších anthokyanidinů (kyanidinu, delfinidinu, malvidinu, pelargonidinu a peonidinu) na transkripční aktivitu jaderných a steroidních receptorů. Transkripční aktivita jaderných receptorů: receptor vitamínu D (VDR), retinoidní X receptor (RXR), receptor kyseliny retinové (RAR), pregnanový X receptor (PXR) a thyroidní receptor (TR) a steroidních receptorů: progesteronový receptor (PR), estrogenový receptor (ER), androgenový receptor (AR), glukokortikoidní receptor (GR) byla hodnocena buď pomocí stabilně nebo transientně transfekovaných buněčných linií s luciferázovým reportérovým genem (gene reporter assay). Testy cytotoxicity a gene reporter assay byly provedeny po 24h inkubaci s testovanými anthokyanidiny s rostoucí koncentrací v rozsahu od 10 nM do 50 µM. Výsledky experimentů ukázaly, že žádný ze zkoumaných anthokyanidinů v testovaných koncentracích nezpůsobuje významnou změnu v transkripční aktivitě studovaných...
|
host ::
RSS.