|
|
Interaction of selected natural substances used in food industry with DNA and its structural motifs
Gardošová, Zuzana ; Pernicová, Iva (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
G-quadruplexes represent secondary DNA structures formed in guanine-rich nucleic acid regions. These structures are involved in many biological processes, including DNA replication, transcription, and telomere maintenance. Several natural substances interacting with G-quadruplex structures have been described. Many of them can be used in the treatment of cancer or other areas of therapeutic practice. G-quadruplexes are dynamic structures whose stability can be affected by a variety of different factors, including chemical modifications to DNA. One of these modifications is DNA methylation, which is an important epigenetic mechanism regulating gene expression. DNA methylation can affect the function and stability of G-quadruplex structures. The theoretical part of the present work focuses on DNA secondary structures, characterization of G-quadruplexes and their ligands and describes the relationship between DNA methylation and G-quadruplex structures. In the experimental part, the binding ability of the natural substances quercetin, berberine, piperine, and caffeine to G-quadruplex structures formed in telomeric oligonucleotide sequences and sequences derived from the proto- oncogene c-Myc was confirmed. Furthermore, the ability of berberine and quercetin was proven to stabilize G-quadruplexes in the aforementioned sequences. Bioinformatics analysis showed that the frequency of G4 is higher in CpG regions than in their surroundings, and the highest frequency of G4 within CpG regions was observed on chromosome 19. Global methylation assays demonstrated that the breast cancer cell line exhibited hypomethylation compared to the non-tumor human dermal fibroblast cell line. After treatment with berberine, the analyzed DNA of both cell lines showed hypermethylation, whereas DNA after interaction with quercetin showed hypomethylation.
|
|
|
Vliv indolových alkaloidů na vybrané buněčné linie a DNA struktury
Dobrovolná, Michaela ; Hoová, Julie (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
G-kvadruplexy (G4) jsou sekundární struktury DNA tvořené seskupením guaninů, u kterých bylo prokázáno, že hrají roli v mnoha biologických funkcích, včetně regulace načasování replikace a potlačení exprese onkogenů. V této práci byly testovány čtyři rostlinné alkaloidy (harmin, harman, harmalin a brucin), jako potenciální G4 ligandy, které by mohly regulovat, indukovat, nebo konvertovat různé topologie G4. Dále byl studován jejich vliv na buněčné linie kožních fibroblastů HDF164 a karcinomu prsu MCF-7, u kterých byl prokázán na dávce závislý mechanismus inhibice růstu. U harminu, harmalinu a brucinu byla potvrzena interakce s paralelním G4 promotoru protoonkogenu c-Myc, u harminu, harmanu a harmalinu s hybridním G4 telomerické DNA. Navíc byla ověřena schopnost testovaných sloučenin interagovat s dvouřetězcovou DNA telecího brzlíku (ctDNA) pomocí UV-Vis absorpční spektroskopie. Metylační test ukázal, že DNA buněk MCF 7 ošetřených harminem a brucinem byla hypermetyovaná.
|
|
|
Analýza vazby proteinu IFI16 na DNA
Kratochvilová, Libuše ; Smetana, Jan (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovatelného proteinu 16 (IFI16) na DNA s potenciálem tvorby G-kvadruplexu. Protein IFI16 obsahuje dvě tandemově umístěné DNA-vazebné HIN domény vykazující rozdílnou vazbu ke strukturám DNA. Bylo prokázáno, že protein IFI16 preferenčně váže struktury G-kvadruplexů oproti jiným strukturám DNA. G-kvadruplexy jsou nekanonické sekundární lokální struktury DNA (nebo RNA), které se snadno formují za fyziologických podmínek v řadě významných regulačních oblastech genomu, nebo jsou součástí genomů řady virů a patogenů. Schopnost rozpoznání, specifické vazby a stabilizace struktur G-kvadruplexů odráží zapojení proteinu IFI16 do buněčných procesů replikace, transkripce a translace a iniciaci vrozených imunitních odpovědí. V první části diplomové práce byly vybranými biofyzikálními metodami charakterizovány sekvence syntetických oligonukleotidů s potenciálem tvorby G-kvadruplexu a izolován protein IFI16 plné délky, který byl následně použit pro in vitro vazebné a kompetitivní vazebné experimenty s charakterizovanými oligonukleotidy. V poslední části práce byly kvasinkové isogenní kmeny lišící se sekvencemi responzivního elementu transformovány plazmidovými vektory pro expresi proteinů p53 a IFI16 s konstitutivními i GAL inducibilními promotory a optimalizován model jednohybridního kvasinkového systému pro studium interakcí proteinu IFI16 in vivo. Z výsledků vyplývá, že většina analyzovaných sekvencí je schopna in vitro tvořit struktury G-kvadruplexu, a to i za přítomnosti pouze jednoho opakování tří a více G-bází. Zatímco přítomnost několika opakování guaninových bází oddělených jednonukleotidovým spacerem vedla k tvorbě intermolekulárních struktur G-kvadruplexů, mutace v původní sekvenci G-kvadruplexu indukovala tvorbu intramolekulárních struktur s rozdílnými konformacemi. In vitro vazebné a kompetitivní vazebné experimenty prokázaly specifickou vazbu proteinu IFI16 ke strukturám G-kvadruplexů bez rozdílů preference vazby proteinu k určité konformaci G-kvadruplexu. Stabilizace struktur G-kvadruplexu in vivo za responzivním elementem transkripčního faktoru (p53) v promotoru reportérového genu indukovala represi transkripce daného genu. Při absenci jakéhokoliv vazebného místa proteinu IFI16 docházelo k protein-proteinové interakci mezi proteiny IFI16 a p53, která vedla ke zvýšení transaktivačního potenciálu proteinu p53, přičemž vazba proteinu p53 a iniciace transkripce reportérového genu byla ovlivněna nejen přítomností motivu G-kvadruplexu a jeho stabilizací, nýbrž i sekvencí DNA sousedící s responzivním elementem p53.
|
|
|
Development of methods for genetic analysis of plant foods
Fialová, Lenka ; Brázda, Václav (oponent) ; Doškař, Jiří (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Multiplex real-time PCR-HRM je analytická metoda, která v posledních letech získává pozornost. Našla si využití např. v diagnostických aplikacích, při kontrole bezpečnosti potravin, i při ověřování jejich autenticity. Optimalizovaná multiplex PCR reakce dokáže poskytnout stejné informace jako odpovídající singleplex PCR reakce za výrazně kratší dobu. První část této práce byla zaměřena na izolaci DNA jak z čerstvého ovoce, tak i z vybraných průmyslově zpracovaných potravin. Na čerstvém ovoci bylo testováno šest různých metod pro izolaci DNA – tři kolonkové kity, dva kity s magnetickými nosiči a jedna konvenční metoda. Z těchto metod byla vybrána jedna, která byla využita pro izolace DNA z různých typů potravin rostlinného původu. Posledně zmíněné experimenty zahrnovaly i optimalizaci zvolené metody. Druhá část této práce byla zaměřena na vývoj triplex PCR metody pro simultánní detekci borůvek, malin a jahod ve vybraných potravinách. Během izolace DNA se chlorid vápenatý ukázal jako vhodný prostředek k odstranění pektinu ze vzorků, a v několika komerčních výrobcích byla prokázána přítomnost malin pomocí sigleplex PCR, ale z naměřených dat byl vyvozen závěr, že pro získání spolehlivějších výsledků jsou potřebné další optimalizace vyvinuté triplex PCR metody.
|
|
|
Eucaryotic cells systems and their biotechnologycal applications
Porubiaková, Otília ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Vorlíčková, Michaela (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The submitted dissertation is divided into several parts. The first part deals with the interactions of the p53 protein and its isoforms with different potential DNA substrates under different experimental conditions. These are predominantly DNA and its non-canonical structural motifs, such as G-quadruplexes or cruciform structures, whose interactions have been studied in yeast isogenic systems or by in vitro methods. The seconds part deals with the bioinformatic analysis of the mentioned secondary DNA structures in different organismal groups, and the result is a set of publications that show their non-random distribution in the genome and their relationship with regulation. The last part of the work contains unpublished results, including the results of testing the effect of natural and synthetic substances on aging in model human cells.
|
|
|
Sekvence tvořící G-kvadruplexy v lidském genu a jeho homolozích pro amyloid beta prekursor
Stránská, Anna ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
APP gen kóduje transmembránový protein amyloid beta prekursor, který je exprimován v mnoha typech buněk, včetně neuronů. Jeho funkce nebyly zatím zcela popsány, je ale zřejmé, že u něj probíhá štěpení před exportem do extracelulárního prostoru. Dochází k jeho degradaci po různých rozkladných drahách a homodimerizaci, při které mohou vzniknout částice s protektivní funkcí neuronů stejně tak jako fragmenty, které jsou toxické a způsobují smrt nervových buněk. Vznik škodlivých amyloidních beta plaků a jejich hromadění mezi neurony v mozku je úzce spjato se vznikem a postupem Alzheimerovy choroby, neurodegenerativního onemocnění mozku projevujícího se smrtí a ztrátou neuronů, která vede k nástupu demence, tedy ztráty kognitivních funkcí. V současné době existuje mnoho výzkumů, které se zabývají souvislostmi mezi neurodegenerativními onemocněními a výskytem G-kvadruplexů v genech, které jsou zapojeny do projevů nemocí. G-kvadruplexy jsou nekanonické sekundární struktury nukleových kyselin DNA a RNA, které vznikají v oblastech bohatých na guanin. Jsou významné především z hlediska jejich spojitosti s biologickými procesy jako je regulace genové exprese v genech a převážně v onkogenech, protože se vyskytují ve významných oblastech genu jako je promotor. Je možné je stabilizovat malými molekulami, a právě této schopnosti je využíváno ve výzkumu terapeutické léčby různých onemocnění. Ke zjištění důležitosti vyplývající z lokalizace a konzervovanosti G-kvadruplexů vyskytujících se v lidském APP genu, byla provedena bioinformatická analýza jak genu člověka, tak 346 dalších genových homologů. Pro tento účel byl použit program G4Hunter, který poskytl informace o nalezených sekvencích s potenciálem tvořit G-kvadruplex, jako je jejich umístění či G4Hunter skóre. Dále byla provedena in vitro analýza pomocí činidla thioflavin T, která otestovala schopnost nalezených sekvencí tvořit G-kvadruplexy za fyziologických podmínek. Výsledky potvrdily přítomnost a evoluční důležitost G-kvadruplexů nalezených v APP genu Homo sapiens a jejich schopnost skládat se v přítomnosti solí jako je sodík a draslík do kvadruplexních struktur.
|
|
|
Vliv makroelementů z potravy na DNA a epigenetický profil
Veselý, Zdeněk ; Kouřilová, Xenie (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Makroelementy obsažené v potravě mají důležitou funkci pro lidský organismus. Podílí se na řadě biochemických reakcí v lidském těle a jejich vyvážené množství je důležité pro prevenci vážných onemocnění. V teoretické části bakalářské práce byla popsána funkce minerálních látek v lidském organismu, funkce DNA a epigenetických mechanismů, jako je metylace DNA nebo modifikace histonů. Byl popsán vliv výživy a funkce vybraných makroelementů – sodík, hořčík, vápník, draslík na epigenetické modifikace a na stabilitu G-kvadruplexů. Cílem experimentální části práce bylo studovat vliv těchto látek na DNA struktury in vitro a připravit experimentálně pro studium in vivo.
|
|
|
Polyphenols in nutritions and their effect on DNA
Osorio, Juan ; Černayová, Diana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Epidemiological studies have shown the effect of plant-derived food consumption in the prevention of a wide range of diseases. The natural antioxidants present in these foods, among which polyphenols are very relevant, may be responsible for this health-promoting activity. The aim of this bachelor thesis is to submit evidence in the interaction of certain polyphenols with the genetic material through different signaling mechanisms, especially regarding the stabilization of the non-canonical DNA structure G-quadruplex and therefore point out the most selective substance to inhibit biochemical processes. Furthermore, the thesis includes detailed information that might help understand how polyphenol compounds can be attached to the DNA through epigenetic mechanisms and G4 structures, and which factors may affect the efficiency of these. Different experiments, by biological and experimental repetition, were used to corroborate the interaction between the compounds and DNA.
|
|
|
Vliv přírodních a syntetických ligandů G4 na transaktivaci p53
Perná, Kristýna ; Smetana, Jan (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V promotorech lidských genů se vyskytují sekundární struktury DNA, jako jsou například G-kvadruplexy. Dysfunkce těchto kvadruplexových struktur byly pozorovány u několika případů nádorových onemocnění, a proto jsou tyto struktury předmětem výzkumu pro návrh nových protinádorových léčiv. Protein p53 je důležitým regulačním proteinem v procesu řízení buněčného cyklu a opravy DNA. Mutace v genu kódující tento protein se objevují u více než 50 % případů onkologických onemocnění. V této práci byl zkoumán vliv přírodních ligandů, vázající se na G-kvadruplexy, na vazbu a aktivitu proteinu p53. V teoretické části diplomové práce byla popsána struktura a vazebné vlastnosti proteinu p53, struktura a role G-kvadruplexů a byly popsány vybrané G4-ligandy vyskytující se v potravinách – kurkumin, kvercetin, berberin a kyselina ellagová. Cílem experimentální části této práce bylo zjistit vliv těchto látek na transaktivační aktivitu proteinu p53 in vivo na základě jejich interakce s G-kvadruplexy pomocí kvasinkových izogenních systémů. Interakce mezi vybranými G-kvadruplexovými strukturami a ligandy byla nejprve ověřena in vitro pomocí ThT testu a cirkulárního dichroismu.
|
|
|
Vliv skladování na mikrobiální složení francouzského sýru Saint-nectaire
Šislerová, Lucie ; Mikulíková, Renata (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Předmětem mé práce je porovnání mikrobiálního složení mezi farmářským a mlékárenským typem sýru Saint-nectaire a vliv doby a teploty skladování na vývoj mikrobiálního složení, obsah mastných kyselin a aromatických látek. Pomocí RT-PCR byly identifikovány vybrané mikroorganismy. U farmářského typu Saint-nectaire byly oproti mlékárenskému typu navíc identifikovány Penicillium roqueforti a fuscoglaucum. U obou typů sýru bylo detekováno nejvyšší množství vybraných mikroorganismů u sýru čerstvého. Při skladování při 20 °C se objevil nárůst oproti sýru čerstvému u těchto mikroorganismů: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Cladosporium herbarum a Penicillium commune a camemberti, a dále byla zaznamenána přítomnost kontaminantů a patogenních organismů. Po týdnu skladování při 20 °C šlo o Micrococcus luteus, Salmonella enterica a Staphylococcus aureus a po dalších dvou týdnech skladování byla navíc identifikována Listeria monocytogenes. Obsah mastných kyselin a těkavých látek byl porovnán u pěti vzorků: sýr čerstvý, sýr skladovaný v lednici po dobu jednoho týdne a tří týdnů a sýr skladovaný při 20 °C po dobu jednoho týdne a tří týdnů. Byl změřen obsah vázaných a volných mastných kyselin, obojí pomocí GC-FID. Obsah vázaných mastných kyselin byl srovnatelný u všech měřených vzorků. Nejvyšší obsah volných mastných kyselin byl u sýru po třech týdnech skladování při 20 °C. Nejvíce zastoupenou mastnou kyselinou je kyselina palmitová. Těkavé látky byly stanoveny pomocí metody HS-SPME-GC-MS. Nejvíce těkavých látek bylo identifikováno v sýru po třech týdnech při 20 °C a v sýru po týdnu v lednici. Nejvíce zastoupenými skupinami byly alkoholy, ketony a kyseliny.
|
host ::
RSS.