Název:
Analýza vazby proteinu IFI16 na DNA
Překlad názvu:
Analysis of IFI16 protein binding to DNA
Autoři:
Kratochvilová, Libuše ; Smetana, Jan (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce) Typ dokumentu: Diplomové práce
Rok:
2023
Jazyk:
cze
Nakladatel: Vysoké učení technické v Brně. Fakulta chemická
Abstrakt: [cze][eng]
Tato diplomová práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovatelného proteinu 16 (IFI16) na DNA s potenciálem tvorby G-kvadruplexu. Protein IFI16 obsahuje dvě tandemově umístěné DNA-vazebné HIN domény vykazující rozdílnou vazbu ke strukturám DNA. Bylo prokázáno, že protein IFI16 preferenčně váže struktury G-kvadruplexů oproti jiným strukturám DNA. G-kvadruplexy jsou nekanonické sekundární lokální struktury DNA (nebo RNA), které se snadno formují za fyziologických podmínek v řadě významných regulačních oblastech genomu, nebo jsou součástí genomů řady virů a patogenů. Schopnost rozpoznání, specifické vazby a stabilizace struktur G-kvadruplexů odráží zapojení proteinu IFI16 do buněčných procesů replikace, transkripce a translace a iniciaci vrozených imunitních odpovědí. V první části diplomové práce byly vybranými biofyzikálními metodami charakterizovány sekvence syntetických oligonukleotidů s potenciálem tvorby G-kvadruplexu a izolován protein IFI16 plné délky, který byl následně použit pro in vitro vazebné a kompetitivní vazebné experimenty s charakterizovanými oligonukleotidy. V poslední části práce byly kvasinkové isogenní kmeny lišící se sekvencemi responzivního elementu transformovány plazmidovými vektory pro expresi proteinů p53 a IFI16 s konstitutivními i GAL inducibilními promotory a optimalizován model jednohybridního kvasinkového systému pro studium interakcí proteinu IFI16 in vivo. Z výsledků vyplývá, že většina analyzovaných sekvencí je schopna in vitro tvořit struktury G-kvadruplexu, a to i za přítomnosti pouze jednoho opakování tří a více G-bází. Zatímco přítomnost několika opakování guaninových bází oddělených jednonukleotidovým spacerem vedla k tvorbě intermolekulárních struktur G-kvadruplexů, mutace v původní sekvenci G-kvadruplexu indukovala tvorbu intramolekulárních struktur s rozdílnými konformacemi. In vitro vazebné a kompetitivní vazebné experimenty prokázaly specifickou vazbu proteinu IFI16 ke strukturám G-kvadruplexů bez rozdílů preference vazby proteinu k určité konformaci G-kvadruplexu. Stabilizace struktur G-kvadruplexu in vivo za responzivním elementem transkripčního faktoru (p53) v promotoru reportérového genu indukovala represi transkripce daného genu. Při absenci jakéhokoliv vazebného místa proteinu IFI16 docházelo k protein-proteinové interakci mezi proteiny IFI16 a p53, která vedla ke zvýšení transaktivačního potenciálu proteinu p53, přičemž vazba proteinu p53 a iniciace transkripce reportérového genu byla ovlivněna nejen přítomností motivu G-kvadruplexu a jeho stabilizací, nýbrž i sekvencí DNA sousedící s responzivním elementem p53.
This diploma thesis deals with the binding of interferon gamma-inducible protein 16 (IFI16) to DNA with the potential of G-quadruplex formation. The IFI16 protein contains two tandemly located DNA-binding HIN domains showing differential binding to DNA structures. IFI16 protein has been shown to preferentially bind G-quadruplex structures over other nucleic acid secondary structures. G-quadruplexes are secondary local structures of DNA (or RNA) that are easily formed under physiological conditions in a number of important regulatory regions of the genome, or are part of the genomes of a number of viruses and pathogens. The ability to recognize, specifically bind and stabilize G-quadruplex structures explains the involvement of the IFI16 protein in the cellular processes of replication, transcription and translation and the establishment of innate immune responses. In the first part of the thesis, the sequences of synthetic oligonucleotides with the potential for G-quadruplex formation were characterized by selected biophysical methods and the full-length IFI16 protein was isolated, which was subsequently used for in vitro binding and competitive binding experiments with characterized oligonucleotides. In the last part of the work, isogenic yeast strains differing in the sequences of the responsive element were transformed with plasmid vectors for the expression of p53 and IFI16 proteins with constitutive and GAL inducible promoters, and the one-hybrid yeast system model was optimized for the study of IFI16 protein interactions in vivo. The results show that most of the analyzed sequences are able to form G-quadruplex structures in vitro, even in the presence of only one run of three or more G-bases. While the presence of several G-runs separated by a single nucleotide spacer led to the formation of intermolecular G-quadruplex structures, mutation in the original G-quadruplex sequence induced the formation of intramolecular structures with different conformations. In vitro binding and competitive binding experiments demonstrated specific binding of the IFI16 protein to G-quadruplex structures without differences in protein binding preference to a particular G-quadruplex conformation. Stabilization of G-quadruplex structures in vivo behind the transcription factor responsive element (p53) in the gene promoter induced repression of the transcription of the given gene. In the absence of any binding site of the IFI16 protein, a protein-protein interaction between the IFI16 and p53 proteins occurred, which led to an increase in the transactivation potential of the p53 protein, while the binding of the p53 protein and initiation of reporter gene transcription was influenced not only by the presence of the G-quadruplex motif and its stabilization, but and the DNA sequence adjacent to the p53 responsive element.
Klíčová slova:
cirkulární dichroismus; elektroforetický test posunu mobility; G-kvadruplex; IFI16; interakce DNA-protein; interakce protein-protein; isogenní kvasinkový systém; luciferázové reportérové testy; p53; circular dichroism; DNA-protein interaction; electrophoretic mobility shift assay; G-quadruplex; IFI16; isogenic yeast system; luciferase reporter assays; p53; protein-protein interaction
Instituce: Vysoké učení technické v Brně
(web)
Informace o dostupnosti dokumentu:
Plný text je dostupný v Digitální knihovně VUT. Původní záznam: http://hdl.handle.net/11012/209597
host ::
